各位读者朋友，今天我们来聊一篇新鲜出炉的论文，由上海交通大学医学院附属第九人民医院完成发表在 Advanced Science 上的重磅研究——“SPSB1 Promotes Subcutaneous Adipose Hyperplasia in Facial Port-Wine Stains by Controlling HDAC1 Degradation and Stability Through Two Distinct Proteolytic Pathways”。这篇研究讲的是一种常见的先天性血管畸形——鲜红斑痣（PWS，俗称“红胎记”），但它的关注点不在血管，而在脂肪。有些患者的红胎记会逐渐“肥厚”，皮下脂肪异常增生，导致面部不对称甚至功能障碍。这背后的细胞和分子“黑手”是谁？研究者用一系列前沿技术，挖出了一个关键角色——SPSB1。

一、问题缘起：血管畸形为何伴随脂肪乱长？
鲜红斑痣多数只是皮肤颜色异常，但进展到肥厚型时，皮下脂肪会显著增多。临床上，这种脂肪增生比血管畸形本身更难处理，且机制不清。传统观点多归因于局部血流改变或炎症，但缺乏直接证据。本研究另辟蹊径，从脂肪组织的“种子细胞”——脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）入手，用单细胞RNA测序把细胞“户口本”翻了个底朝天。

二、单细胞“点名”：揪出一群爱长胖的ASPC亚群
接受手术的患者均表现为典型的增生型鲜红斑痣（PWS）和明显的面部肥大，且H&E染色和油红O染色显示PWS的皮下脂肪组织含有更多小血管，脂质积累明显增加（图1A-D）。研究者收集了肥厚型PWS患者和正常对照的面部脂肪，提取基质血管组分（SVF）进行单细胞测序。聚类分析显示，PWS组的ASPCs虽然比例与对照组相近，但促脂肪生成基因（如Cebpa、Cebpb、Klf4）表达显著升高，且富集到“脂肪细胞分化”通路（图1J）。
进一步细分ASPCs为9个亚群（图1K），其中ASPCs-4、-5、-6在PWS组中比例明显增加（图2D-E）。而这三个亚群有一个共同特点——高表达SPSB1（图2F）。SPSB1是什么？它是Cullin-RING E3泛素连接复合体的“接头蛋白”，专门负责给靶蛋白“贴泛素标签”，指引其走向降解。那么，SPSB1为何会在PWS的ASPCs中高表达？研究者通过SCENIC转录调控网络分析发现，转录因子FOSL1在PWS-ASPCs中活性增强，并通过ChIP-qPCR和荧光素酶报告实验证实FOSL1直接结合SPSB1启动子并激活其转录（图2J-O）。

图1 患有或未患有肥大型普拉德-威利综合征（PWS）患者脂肪组织中SVF的细胞构成

图2 SPSB+ ASPCs是普拉德-威利综合征（PWS）患者脂肪组织中的一种独特亚群

三、功能验证：SPSB1是脂肪生成的“油门”
体外实验表明，在PWS-ASPCs中敲低SPSB1，油红O染色变浅，PPARγ、C/EBPα等脂肪标志蛋白下降（图3E-G）；而过表达SPSB1则显著促进脂滴积累（图3H-J）。体内实验更加直观：将改造后的ASPCs与Matrigel混合植入裸鼠皮下，4周后取出“人造脂肪瘤”观察——SPSB1敲低组的脂肪细胞少且小，过表达组则又大又饱满（图3K-L）。这说明SPSB1在体内外都是实实在在的“促胖因子”。
图3 SPSB1在体外和体内促进脂肪生成

四、分子机制：SPSB1的新“猎物”是表观调控因子HDAC1

SPSB1作为E3接头蛋白，其功能依赖于识别并泛素化特定底物。研究者用免疫共沉淀联合质谱（IP-MS）寻找SPSB1的互作蛋白，结果HDAC1赫然在列（图4A-B）。HDAC1是组蛋白去乙酰化酶，它的工作是“擦除”组蛋白上的乙酰基，让染色质更紧密，从而抑制基因转录。如果HDAC1被降解，染色质就会“松开”，基因得以表达。

通过免疫荧光共定位、邻位连接技术（PLA）和免疫共沉淀（Co-IP），研究者证实SPSB1与HDAC1确实存在直接结合（图4D-G）。结构域分析显示，SPSB1的SPRY结构域（33-231 aa）结合HDAC1的N端半段（1-320 aa）（图4H-J）。关键位点突变实验进一步锁定了两者结合所必需的关键氨基酸残基（图4K）。

图4 SPSB1 与 HDAC1 发生了物理相互作用

五、降解细节：两种泛素链，指向两条不同的“垃圾处理”通路

SPSB1如何调控HDAC1的蛋白水平？Western blot显示，SPSB1过表达使HDAC1蛋白下降但不影响其mRNA（图5A-D），说明是翻译后调控。通过环己酰胺（CHX）追踪实验，发现SPSB1加速HDAC1降解（图5I-K）。泛素化实验进一步确认SPSB1促进HDAC1的多聚泛素化（图5L-M）。

更精细的“泛素链类型”实验使用了仅保留单一赖氨酸的泛素突变体，结果显示SPSB1主要在HDAC1上组装K29-和K48-连接的泛素链（图5N）。K48链通常引导底物进入蛋白酶体（UPS），而K29链近年被报道与自噬-溶酶体（ALP） 降解相关。

为了明确具体修饰位点，研究者将HDAC1上预测的赖氨酸逐一突变，最终锁定K89和K361两个关键位点（图6G-H）。K89R或K361R突变均削弱SPSB1介导的泛素化及降解（图6I-J）。那么哪个位点对应哪种链呢？他们分别用K29-only和K48-only泛素进行检测，发现K89主要被K48链修饰，K361主要被K29链修饰（图6O-R）。HDAC1双突变体（2KR）对SPSB1完全“免疫”（图6S-U）。而且，K89R或K361R突变的HDAC1抑制脂肪生成的能力比野生型更强（图6V-Y），说明HDAC1本身确实是脂肪生成的“刹车”。

双重降解通路验证（图7A-P）：用MG132（蛋白酶体抑制剂）或氯喹（CQ，溶酶体抑制剂）单独处理，都能部分阻断SPSB1引起的HDAC1下降；两者联用则几乎完全恢复HDAC1水平。进一步敲低PSMD4（蛋白酶体亚基）后，CQ仍能部分阻断，但若同时敲低PSMD4并加CQ，则完全阻断，表明两条通路独立且协同。对于K361R突变体，MG132有效恢复HDAC1，而CQ则无效（图7G-H），说明K361的K29链指向溶酶体。研究者还发现K361泛素化增强HDAC1与分子伴侣HSC70的结合，从而被引导至溶酶体进行分子伴侣介导的自噬（CMA）（图7U-V）。

图5 SPSB1介导了HDAC1的K29和K48连接的多泛素化

图6 HDAC1在K89和K361位的泛素化依赖于SPSB1的SOCS结构域

图7 SPSB1通过两条蛋白水解途径促进了HDAC1的降解

六、表观基因组重编程：HDAC1降解后，脂肪基因全“开”了
HDAC1被降解后，组蛋白乙酰化水平发生剧烈变化。Western blot显示，HDAC1敲低或用Entinostat（HDAC抑制剂）处理后，H3K27ac和H3K9ac水平显著上升（图8F-G）。ChIP-qPCR验证这些乙酰化mark在脂肪生成关键基因（CEBPA、CEBPB、FABP4）启动子区域富集增加（补充图S8E-F）。
RNA-seq分析显示，HDAC1敲低后281个基因上调、250个下调（图8A），上调基因显著富集于“脂肪酸代谢”和“PPAR信号通路”（图8D-E）。而ATAC-seq更是直观地展示了“染色质开放性”的全景变化——HDAC1敲低后，全基因组范围内转录起始位点（TSS）附近的ATAC信号显著增强（图8H）。把ATAC-seq和RNA-seq数据进行整合，发现有77个基因的启动子开放性与转录水平同步改变，其中68个上调，包括Cebpa、Cebpb、Fabp4等知名脂肪生成驱动器（图8M）。

图8 HDAC1通过转录重编程调控脂肪生成

七、正反馈回路：SPSB1越“嗨”，脂肪越“嗨”
故事并未结束。研究者发现HDAC1不仅抑制脂肪生成基因，还直接抑制SPSB1自身的转录。ATAC-seq显示，HDAC1敲低后SPSB1基因启动子区域染色质开放性增加（图9A-B）。ChIP-qPCR证实，HDAC1敲低后SPSB1启动子上的H3K27ac和H3K9ac富集增加（图9C）。蛋白和mRNA水平均证实HDAC1敲低会上调SPSB1（图9D-E）。这就形成了一个正反馈回路：SPSB1→降解HDAC1→解除HDAC1对SPSB1的转录抑制→更多SPSB1……这一回路一旦启动，脂肪生成便“停不下来”。用HDAC抑制剂Entinostat处理也能上调SPSB1，进一步验证了该调控关系（图9F）。

最终，研究者通过“人造脂肪瘤”模型进行了功能回复实验：单独敲低SPSB1减少脂肪；同时敲低HDAC1则可部分“挽救”脂肪生成（图9G-L）。这证明SPSB1的促脂肪效应确实依赖HDAC1。

图9 SPSB1-HDAC1正反馈回路调控脂肪生成

八、总结与临床转化前景

综合所有结果，本研究描绘了一条清晰的分子通路：

FOSL1→上调 SPSB1→SPSB1通过K48/K29泛素化引导 HDAC1 经蛋白酶体和溶酶体双重降解→HDAC1减少使组蛋白乙酰化（H3K27ac/H3K9ac）升高、染色质开放→脂肪生成关键基因（PPARG、CEBPA、FABP4等）激活→同时SPSB1自身启动子也因HDAC1缺失而变得活跃，形成正反馈 → 脂肪不断增生。

这一发现不仅解释了肥厚型PWS脂肪增生的根本机制，还提供了两个潜在治疗靶点：抑制SPSB1或激活HDAC1（或使用HDAC激动剂）均可能阻断这一过程。当然，HDAC1全局激活可能带来副作用，但局部给药或靶向SPSB1的小分子可能更安全。

九、京房生物能提供的服务

这篇论文在技术上堪称表观基因组学与单细胞组学融合的范例。其中涉及的多种技术，正是我们京房生物的重点服务方向：

• 单细胞测序：用于发现稀有细胞亚群和特异性标志物。我们提供10x Genomics平台的全流程服务，包括单细胞转录组、单细胞ATAC和单细胞多组学。
• ATAC-seq：本研究用它证明HDAC1调控染色质开放性的全局效应。我们的ATAC-Seq建库技术成熟，可处理临床穿刺样本、冻存细胞甚至FFPE样本，并且有自主研发的优化方案以提高信噪比。
• ChIP-seq / CUT&Tag：用于组蛋白修饰和转录因子结合分析。本研究用了ChIP-qPCR，但大规模全基因组范围时，ChIP-seq或CUT&Tag是更高效的选择。京房生物的CUT&Tag服务尤其适合低细胞量样本，数据质量高。
• RNA-Seq：差异表达基因鉴定。我们提供标准mRNA测序及全转录组测序，并可配合ATAC-seq数据进行联合分析。
• 多组学整合：本研究将ATAC-seq和RNA-seq数据重叠，找到77个一致性变化基因。我们拥有成熟的生物信息学团队，可完成类似整合分析，并提供可视化报告。

此外，研究涉及甲基化？本文未直接涉及，但HDAC1调控乙酰化，而乙酰化与甲基化存在crosstalk。我们京房生物在甲基化测序（WGBS、RRBS） 和甲基化时钟方面也有深厚积累，已构建人鼠多种组织类型的甲基化时钟模型，可用于年龄推断、疾病风险评估等。

我们希望这篇解读能让您看到：表观基因组学不是枯燥的“组蛋白修饰”，而是理解疾病机制、发现新靶点的利器。 如果您正在从事脂肪代谢、血管畸形、肿瘤或再生医学相关研究，欢迎随时联系我们，探讨技术方案。
京房生物，专注表观基因组学与多组学技术，助您探索基因调控的未知疆域。欢迎关注公众号，获取更多前沿解读和技术干货。