2025年发表于《Cell Rep》（IF=6.9）

一、研究背景
DDX3X属于DExD/H-box解旋酶家族，参与RNA代谢的多个方面，并在抗病毒先天免疫中发挥作用。DDX3X在多种癌症中经常发生突变，但其致癌或抑瘤功能仍存在争议。EB病毒（EBV）是一种致癌病毒，与多种癌症和炎症性疾病相关，其裂解基因在肿瘤发生中可能起重要作用。R-loop是一种三链核酸结构，其异常积累可导致基因组不稳定，与肿瘤发生密切相关。本研究旨在探讨DDX3X突变与EBV感染之间的功能相互作用，以及它们如何共同诱导R环依赖性肿瘤发生。

二、研究结果

1、DDX3X突变的泛癌分析及其生物学和结构改变

DDX3X突变在淋巴恶性肿瘤（如Burkitt淋巴瘤、NKTCL和DLBCL）中显著富集，这些癌症类型与EBV感染密切相关（图1A）。DDX3X突变主要集中在两个高度保守的D1和D2结构域（图1B）。GO富集分析表明DDX3X突变导致与免疫反应、病毒反应和RNA解旋酶功能相关的基因表达发生变化（图1C-D）。Western Blot和ELISA实验表明STING和IRF-7的表达和磷酸化水平低于DDX3X^WT（图1E-F）。

图1 DDX3X通过STING/IRF-7介导的IFN-α/β激活调节抗病毒先天免疫

2、DDX3X突变诱导EBV裂解基因BNLF2b过表达

DDX3X突变细胞中的EBV病毒拷贝数显着更高（图1G）。只有 BNLF2b 表达在 DDX3X 突变时显着上调，而其他EBV基因的表达水平保持不变（图1H ）。DDX3X的突变可能影响细胞对外源性EBV感染的反应，导致BNLF2b基因表达的上调（图1I）。在外源性EBV感染时，STING抑制剂C-176使BNLF2b表达水平进一步增强，而IRF-7激活剂CL075可挽救这一增强（图1J）。DDX3X发生突变时，观察到DDX3X蛋白BNLF2b RNA之间存在显著的共定位现象（图1K）。DDX3X中的449_450ET>DP或A404P型突变会减弱其与dsRNA的结合能力（图1L）。

图1 DDX3X通过STING/IRF-7介导的IFN-α/β激活调节抗病毒先天免疫

3、DDX3X突变会损害RNA结合亲和力

DDX3X蛋白的A404P突变破坏氢键、改变ATP结合残基位置，导致ATP结合/水解条件不利，使RNA与蛋白相互作用失效（图2A-B）。而449_450ET>DP突变增大了蛋白整体结构波动（图2C），其突变体呈现显性“扭曲”构象，D2结构域顺时针旋转30°，与WT的“原位”构象形成对比（图2D）。D2相对于D1移位更大，破坏了氢键，并导致D1/D2界面面积显著减少，并且它的晶体结构与RNA结合结构的差异最大（图2E-G）。总之，DDX3X^449_450ET>DP突变具有最不利于RNA结合的显性构象，成为代表性的 DDX3X 突变。

图2 DDX3X的结构表征A404P型和DDX3X449_450ET>DP

4、转基因小鼠模型概括了R环依赖性致癌过程

通过CRISPR-Cas和腺相关病毒（AAV）介导，成功构建了Ddx3x^fl/+(Y), pAAV-BNLF2b转基因小鼠模型（图3A）。该小鼠出现脾肿大现象（图3B）。IF/FISH实验证实DDX3X和BNLF2b在小鼠脾脏中共定位（图3C）。染色结果显示，该小鼠的脾脏、肝脏和骨髓中有异常细胞增殖（图3D-E）。G带核型分析显示，Ddx3x^fl/+（Y）小鼠的骨髓染色体存在非整倍体现象，引入pAAV-BNLF2后增强。流式细胞术分析发现，Ddx3x^fl/+（Y）小鼠中CD3−CD19−NK1.1+淋巴细胞簇显著增加，而T细胞、B细胞的比例不变（图3F-G）。

图3 DDX3xfl/+（Y），pAAV-BNLF2b 转基因小鼠模型概括了R环介导的致癌过程

从Ddx3x^fl/+, pAAV-BNLF2b小鼠的骨髓和脾脏中分离出的多种细胞用于研究恶性表型（图4A）。流式细胞术显示，CD3−CD19−NK1.1+淋巴细胞中BNLF2b表达显著升高，Ki67+细胞比例增加，同时，大量细胞共表达Ki67和BNLF2b（图4B-C）。Ddx3x^fl/+, pAAV-BNLF2b小鼠的CD3−CD19−NK1.1+淋巴细胞具有更强的多层生长和细胞转化能力（图4D）。移植了该细胞的受体小鼠增殖能力更强，其脾脏和肝脏细胞浸润更明显（图4E-G）。综上所述，DDX3X突变在EBV裂解基因 BNLF2b 的帮助下，突变表现出致瘤潜力。

图4 CD3−/CD19−/NK1.1+淋巴细胞的恶性表型

5、DDX3X突变改变R环平衡和基因组不稳定性

介绍了NK-92细胞中DRIPc-seq实验，发现表达外源BNLF2b的DDX3X^MUT细胞出现大规模的R环诱导，受影响区域与有丝分裂细胞周期、RNA代谢和免疫反应相关，且相关基因在 DDX3X 突变患者中显着失调（图5A-D）。与野生型相比，DDX3X^MUT细胞在BNLF2b过表达时显示出更广泛的R环积累，可被RNase H处理消除，证实为真正的R环（图5E）。STING抑制剂增加R环的积累，而IRF-7激活剂相反（图5F）。DDX3X突变体与RNA-DNA和DNA-RNA杂交体的结合力降低（图5G）。DDX3X^MUT细胞中，BNLF2b的外源表达使染色体异常核型显著增加，而在野生型中无此现象（图5H-I）。总之，DDX3X 突变先天免疫受损、核苷酸结合亲和力降低，增强 BNLF2b 过表达和异常R环积累，驱动了基因组不稳定性介导的癌症发展。

图5 DDX3X突变和BNLF2b合作诱导R环积累

6、DNA损伤剂触发DDX3X^mutBNLF2b+肿瘤的合成致死性

依托泊苷（etoposide），一种抗癌药物，它对DDX3X突变细胞更有效，在EBV感染或BNLF2b过表达的细胞中显示出更高的敏感性。该药物能增强DNA双链断裂标志物γ-H2AX的表达，并诱导caspase-3发生裂解（图6A-B）。值得注意的是，去除R环可显著增加对依托泊苷的耐药性（图6C）。依托泊苷处理的受体小鼠中观察到CD45.2+CD3−CD19−NK1.1+细胞的增殖受到显著抑制，同时γ-H2AX、R环及裂解的caspase-3阳性细胞数量有所增加（图6D-E）。此外，DDX3X突变患者在接受依托泊苷治疗后，生存率显著提高（图6G）。作为一种作用机制（图6H），DDX3X突变抑制了EBV裂解基因BNLF2b的抗病毒免疫并增强了过表达，这有助于DDX3X突变诱导异常的R环积累和相关的基因组不稳定性，以R环依赖性方式赋予肿瘤发生。

图6 依托泊苷诱导具有治疗潜力的合成致死性 DDX3XmutBNLF2b肿瘤+

三、研究结论
本研究发现DDX3X突变与Epstein-Barr病毒（EBV）合作，通过诱导R环依赖性肿瘤发生机制促进癌症发展。DDX3X突变损害先天免疫，促进EBV裂解基因BNLF2b表达，进而导致R环积累、基因组不稳定和异常增殖。此外，DNA损伤剂依托泊苷可增强R环与γ-H2AX的共定位，触发DDX3X突变肿瘤的合成致死性，为治疗相关癌症提供了潜在的新靶点。

参考文献：
DDX3X mutation and Epstein-Barr virus cooperate to induce R-loop-dependent oncogenesis.