2024年发表于《Blood》（IF=20.9）

一、研究背景
炎症与凝血密切相关，先天免疫系统调节凝血、止血和血栓形成。Toll样受体被脂多糖等激活，产生干扰素、TNF-α、IL-1β等炎性细胞因子，从而促进组织因子（tissue factor，TF）的表达和凝血。凝血酶在控制出血和血栓形成中起核心作用，通过凝血-炎症轴发挥止血和促凝作用。补体系统通过因子C3a和C5a结合受体C3aR和C5aR诱导炎症和血栓形成，引发早期炎症反应。在血栓形成和血管损伤过程中，中性粒细胞的炎症反应是一个渐进的过程，包括各种酶和活性物质的释放。先天免疫介质中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）已被报道与心血管疾病相关。

二、研究结果

1、先天性免疫介质NGAL在深静脉血栓患者中显著上调

高凝状态的特征是凝血系统异常，会增加血栓形成的风险。静脉血栓栓塞是这种疾病最常见的表现。使用DIA-MS分析了DVT患者和健康个体血浆中的差异蛋白表达（图1A）。先天免疫介质NGAL在深静脉血栓患者中显著增加，NGAL与心血管疾病有关。NGAL在凝血和炎症与血栓形成之间的串扰中可能具有替代功能，使用ELISA试剂盒进一步测定了DVT患者、STEMI患者和健康个体血浆中NGAL的平均浓度。与STEMI患者相比，DVT患者的NGAL水平明显更高（图1B）。检测DVT恢复后一年患者的NGAL浓度，发现与患病期间相比，NGAL水平下调（图1B）。这些结果表明NGAL和高凝性之间存在潜在的联系。

图1 深静脉血栓患者血浆中NGAL水平明显上调

2、NGAL增强多种凝血因子，同时抑制抗凝血酶

为了研究NGAL诱导高凝的潜在机制，评估了NGAL对凝血和血小板的影响。如图2A-C所示，发现NGAL通过缩短人血浆的再钙化时间来促进凝血；NGAL单克隆抗体治疗可显著延长人血浆APTT和PT，而对照IgG则无影响（图2D和E）。NGAL增强了凝血酶、钾化激酶、FXIa和FVIIa的活性（图2F）而对FXIIa、FIXa、FXa和纤溶酶无影响（图2G）。NGAL增加了凝血酶、钾化因子、FXIa和FVIIa对其天然底物：纤维蛋白原、FXII和FIX的酶活性（图2H-J）。如图2I和J图所示，NGAL增强了FXIa和FVIIa水解FIX的能力。这表明NGAL在提高FXIa和FVIIa对FIX的催化活性中起作用。此外，体外研究表明，NGAL阻碍TAT复合物的形成，抑制抗凝血酶对FIXa的活性，如图2K和L所示。血栓弹性成像分析显示，NGAL在诱导凝血和血小板方面发挥了关键作用（图2N）。总之，表明NGAL通过多种机制促进高凝性。

图2 NGAL增强多种凝血因子，抑制抗凝血酶，诱导TF表达

3、NGAL上调TF在细胞表面的表达和活性

研究了NGAL对内皮细胞和单核细胞中TF表达和活性的影响。将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人单核细胞系（THP-1）分别暴露于不同浓度的NGAL中24h。WB分析结果显示TF表达显著增强（图2O-R）。NGAL处理导致THP-1细胞表面TF活性增加（图2T）。

图2 NGAL增强多种凝血因子，抑制抗凝血酶，诱导TF表达

4、NGAL直接与凝血酶、钾化酶、FXIa、FVIIa和抗凝血酶相互作用

SPR分析结果表明，NGAL与凝血酶、钾化激酶、FXIa、FVIIa和抗凝血酶直接相互作用（图3A-E）。NGAL不与FXIIa、FIXa、纤溶蛋白或FXa相互作用。共免疫沉淀分析显示NGAL与凝血酶原/前激肽释放酶/FXI/FVII/抗凝血酶之间存在生理相互作用（图3F），共聚焦显微镜也证实了在DVT中NGAL与凝血酶/激肽释放酶/FXIa/FVIIa/抗凝血酶之间存在生理相互作用（图3G）。血栓中形成了NGAL-凝血酶/激肽释放酶/FXIa/FVIIa/抗凝血酶复合物（图3G）。建立了NGAL-激肽释放酶蛋白相互作用对接模型（图3H）。肽DQ10和KR8抑制了NGAL对激肽释放酶的增强作用（图3I-M），并通过SPR分析与NGAL相互作用（图3N、O），表明介导NGAL与激肽释放酶蛋白相互作用的关键区域位于激肽释放酶蛋白酶结构域的两个外源性环的456-465（DQ10）和585-591（KR8）上。

图3 NGAL与凝血因子的直接相互作用

5、NGAL过表达促进凝血和止血，而NGAL缺乏则减弱这些过程

评估了NGAL过表达、静脉给药、NGAL单克隆抗体干扰和NGAL缺乏对血浆凝血酶活性、APTT、PT和血栓弹性成像等各项指标的影响。结果显示，AAV9-NGAL小鼠和静脉注射NGAL小鼠血浆凝血酶活性显著升高，APTT和PT缩短（图4A-C）；NGAL单克隆抗体-处理小鼠结果相反。采用小鼠尾出血和隐静脉出血模型研究发现，AAV9-NGAL和静脉注射NGAL小鼠明显缩短尾出血和隐静脉出血时间（图4E和F）；NGAL单克隆抗体处理小鼠结果相反。

为了进一步证明NGAL在凝血止血中的关键作用，对NGAL敲除小鼠进行凝血止血实验。NGAL基因敲除的显著降低血管的TF表达和循环血浆TF,血浆凝血酶活动,MA值,和长时间R,K,APTT、PT、和tail-bleeding时间(图4G-L)。过表达的AAV9-NGAL补充了NGAL缺失，可以逆转NGAL敲除小鼠的这些变化（图4H-J、L）。NGAL敲除对血浆铁浓度无影响，表明其相关凝血表型与铁相关凝血途径无关。这些结果共同表明NGAL在凝血和止血中起着至关重要的作用。

图4 NGAL可诱导高凝和止血，而缺乏NGAL可逆转高凝和止血

6、NGAL缺乏可减轻血栓倾向，而NGAL过表达则相反
采用FeCl3诱导小鼠血栓形成模型和DVT模型，进一步研究NGAL在高凝和血栓形成中的作用。NGAL过表达和静脉给药小鼠颈动脉和深静脉的动脉血流减少（图5A和B），静脉血栓形成加剧（图5C、D），而NGAL单克隆抗体处理小鼠结果相反（图5A-D）。在10% FeCl3诱导下，NGAL敲除小鼠的动脉闭塞时间明显延长（图5E、F）。此外，NGAL敲除可以显著抑制静脉血栓形成（图5G和H）。NGAL补体可以逆转NGAL敲除小鼠的凝血障碍，而AAV9对照则没有作用（图5E-H）。说明NGAL在血栓形成调控中具有重要作用。

图5 缺乏NGAL可减轻血栓形成，而NGAL过表达可加重血栓形成

7、NGAL缺乏可减轻小鼠炎症性血栓

研究了NGAL对脂多糖或卡拉胶诱导的血栓形成的影响。NGAL敲除可以显著抑制LPS诱导的动脉和静脉血栓（图6A-D）。诱导24小时后，在卡拉胶诱导的小鼠中观察到大量尾部血栓形成（图6E-H）。NGAL过表达和静脉给药促进了尾静脉血栓的生长，相反，NGAL单克隆抗体治疗可以显著抑制血栓的形成，而对照AAV9和IgG没有作用（图6E-H）。此外，NGAL敲除可以显著抑制卡拉胶诱导的尾静脉血栓形成（图6I和J）。这些结果表明，NGAL介导了炎症与血栓之间的串扰。

图6 缺乏NGAL可减轻小鼠炎症性血栓，补充NGAL可逆转炎症性血栓

三、研究结论

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）在血栓患者中上调，有助于凝血、止血和血栓形成。NGAL过表达或静脉给药均能促进凝血和止血，加重血栓形成；而NGAL敲除或抗NGAL单克隆抗体治疗可显著延长出血时间，减轻血栓形成。抗NGAL单克隆抗体治疗可显著减少炎症诱导血栓模型中血凝块的形成。本研究揭示了NGAL在凝血、止血和血栓形成过程中的作用，以及先天免疫、炎症和凝血之间的相互作用。因此，调节NGAL水平可能有助于平衡血栓和出血风险。

参考文献：
Deficiency of neutrophil gelatinase-associated lipocalin elicits Hemophilia-like bleeding and clotting disorder.[J]Blood, 2024. https://doi.org/10.1182/blood.2024026476.