2024年发表于《Genome Biol》（IF=10.8）

一、研究背景
转座元件（TEs）在哺乳动物基因组中占据重要地位，其中短散在核元件（SINEs）在神经发育中发挥关键作用。SINEs本身不编码蛋白质，但可以在转录功能RNA或充当增强子，影响神经发生、神经元成熟和神经网络建立等过程。表观遗传调控，如DNA甲基化和组蛋白修饰，在神经发育中起着关键作用，而H3K9me3和CTCF等表观遗传标记在TEs调控中发挥重要作用。SETDB1是一种组蛋白甲基转移酶，靶向H3K9me3，在TEs调控中发挥关键作用，尤其是抑制LTR类TEs，包括ERVs。然而，SETDB1在SINEs调控中的作用尚不清楚，本研究旨在阐明其调控机制。

二、研究结果
1、小鼠NPC中敲除 SETDB1 SINE_B2元件上的染色质可及性增加

与野生型神经祖细胞相比， SETDB1敲除小鼠神经祖细胞（NPC）中，超过65%的染色质可及性增加峰位于TEs，其中近一半与SINE_B2元件相关（图1A-B）。SINE_B2元件表现出较高的染色质可及性，尤其在基因丰富区域，提示其潜在的调控功能(图1C-D)。 SETDB1敲除组中，SINE_B2元件的染色质可及性显著增加，且主要分布在基因丰富区域（图1E-G）。染色质可及性增加和H3K9me3减少的SINE_B2元件富含CTCF结合位点(图1H)。这些发现表明，NPC定SINE_B2元件群的染色质可及性受SETDB1控制。

图1 小鼠神经前体细胞SETDB1敲除后SINE_B2元件上的染色质可及性增加

2、NPC中敲除 SETDB1 H3K9me3在SINE_B2上表达降低
H3K9me3 ChIP-seq结果显示，野生型和SETDB1敲除组之间存在显著差异，并且SETDB1敲除组中，H3K9me3下调峰的数量显著增加，且这些峰主要位于基因区和TEs（图2A-B）。H3K9me3和ATAC-seq信号在SINE_B2元件上的分布情况结果表明，在野生型中，H3K9me3信号主要分布在染色质可及性增加的SINE_B2元件上，而在SETDB1敲除组中，H3K9me3信号几乎消失，并且H3K9me3下调峰的染色质可及性显著增加（图2C-G）。这些发现表明SETDB1敲除NPC中H3K9me3信号的丢失可能有助于在SINE_B2元件上观察到的染色质可及性增加。

图2 NPC中SETDB1敲除后H3K9me3在SINE_B2上的减少

3、NPC中敲除 SETDB1会导致DNA甲基化发生改变
SETDB1敲除组中，差异甲基化区域（DMR）的数量显著增加（图3A）。相比于野生型，SETDB1敲除组的DNA甲基化水平总体上在TEs区域有所降低，在SINEs区域降低幅度更大，在非TEs区域略有升高（图3B），SINE_B2区域的DNA甲基化水平降低的区域（DMR_hypo）显著富集，LTR区域的DNA甲基化水平有所降低（图3C-D）。SETDB1敲除组中，大量DMR和ATAC-seq峰位于染色质可及性增加的区域，且H3K9me3信号几乎消失（图3E-F）。在野生型中，H3K9me3信号和DNA甲基化水平在染色质可及性增加的SINE_B2元件上较低，而在SETDB1敲除组中，DNA甲基化水平进一步降低（图3G）。这些研究表明DNA甲基化也参与了SETDB1介导的NPC中B2元件的抑制。

图3 NPC中 敲除 STEBD1后DNA甲基化的改变

4、NPC 中 敲除SETDB1导致CTCF与SINE_B2结合的增加
SETDB1敲除导致CTCF结合显著增加，表现为CTCF结合峰数量增加，信号增强（图4A）。CTCF结合峰主要富集在SINE_B2元件上，尤其是B3A和B3亚型，并且CTCF结合峰与ATAC-seq高峰存在显著重叠，表明CTCF结合与染色质开放性相关（图4B-C）。敲除SETDB1导致CTCF结合峰上的H3K9me3信号降低和DNA甲基化水平降低（图4D-H）。CTCF结合峰主要位于非启动子区域，表明CTCF可能通过染色质相互作用间接调控基因表达(图4I)。这些发现强调了NPC中敲除SETDB1后CTCF对SINE_B2元件结合增加的特异性。

图4 NPC中敲除SETDB1后CTCF结合在SINE_B2上的增加

5、敲除SETDB1导致CTCF结合增加，SINE_B2上染色质环重组
野生型和SETDB1敲除小鼠NPC中拓扑关联结构域(TAD)的宽度分布以及TAD边界的绝缘分数热图和轮廓图均没有显著差异（图5A-B）。SETDB1敲除组的染色质环接触强度显著降低，导致染色质环之间连接减弱（图5C）。SETDB1敲除小鼠NPC中NLA的数量明显增加，LLA的数量明显减少，ULA的数量变化不大，并且NLA上的CTCF结合信号明显和重叠数量都增加，而LLA和ULA上的CTCF结合信号没有显著变化（图5D-F）。CTCF结合位点主要以convergent (><) 方式锚定在染色质环锚点上，而NLA主要与CTCF_up_B2相重叠（图5G-I）。这表明，尽管增加的CTCF结合不会干扰TAD的构象，但由于NPC中SETDB1的丢失，它可能有助于染色质环的重组。

图5 敲除SETDB1后CTCF结合增加，SINE_B2上染色质环重组

6、敲除SETDB1后染色质环重组与差异基因表达
敲除SETDB1，形成了新的染色质环的锚定点，与DEG启动子的重叠程度显著高于丢失环和未改变环，新环锚定点上的DEG表达水平较高，且在聚类分析中呈现出明显的特征（图6A-B）。SETDB1敲除后表现出更高的染色质可及性、H3K9me3水平降低、DNA甲基化水平降低和CTCF结合增加(图6C)。这些DEG富集于与有丝分裂染色体分离相关的网络和通路(图6D)，而且其启动子区域富集了CHR（细胞周期基因启动子的同源区域），以及JunD、NRF1和Sp转录因子的结合位点(图6E-F)。SETDB1敲除后，Cenpe基因的启动子与CTCF_up_B2元素重叠，CTCF结合增加（图6G）。这些数据表明，由于CTCF与B2元件的过度结合，KO中新形成的染色质环导致SETDB1敲除NPC中有丝分裂基因的失调。

图6 与SETDB1敲除后环重组相关的差异基因表达

7、敲除SETDB1导致NPC增殖受损
SETDB1敲除组的神经球直径显著小于野生型组，表明SETDB1敲除组神经祖细胞的增殖能力下降（图7A）。SETDB1敲除组的G2/M期细胞比例显著降低，而G1期细胞比例呈现上升趋势，表明SETDB1敲除组细胞可能进入G1期的时间延长，或从G1期到S期的转变减慢（图7B）。ETDB1敲除组的BrdU标记细胞和磷酸化组蛋白H3标记细胞数量也显著减少（图7C-D）。总之，从体外和体内研究中获得的结果表明，由于 SETDB1 的缺失，导致神经祖细胞增殖能力下降，细胞周期变慢，有丝分裂减少。

图7 敲除SETDB1后NPC增殖受损

三、研究结论
SETDB1通过H3K9me3和DNA甲基化限制小鼠神经前体细胞定SINE_B2元件的染色质可及性。SETDB1基因敲除导致这些元件上的CTCF结合增加，会促进染色质环重组，这种重组会影响基因表达，特别是与有丝分裂相关的基因，最终破坏神经前体细胞的增殖。总之，SINE_B2元件在神经发育中的表观遗传调控和细胞增殖中起着重要作用。

参考文献：
SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells. Genome Biol. 2024 Jul 3