2024年发表于《Science Translational Medicine》（IF=15.8）


一、研究背景
胃癌（Gastric cancer，GC）是全球第五大常见恶性肿瘤，5-氟尿嘧啶（5-FU）联合铂类药物作为晚期胃癌的一线化疗方案，探讨5-FU耐药的机制有重要的临床意义。氧化磷酸化（OXPHOS），是各种肿瘤类型中化疗耐药细胞的一个显著特征。Nitrilase家族成员2（NIT2）是Nitrilase超家族的成员，NITs是一种潜在的肿瘤抑制因子，可诱导细胞凋亡周期阻滞。

二、研究结果
1、NIT2作为5-FU化学敏感蛋白介导胃癌5-FU耐药
使用CRISPR-Cas9文库靶向GC细胞系MKN45中的人代谢酶，用5-FU进行筛选（图1A）。在之前未表征的5-FU敏感性增强基因中，NIT2在该分析中成为最丰富的基因之一（图1B）。在5-FU处理下，消耗NIT2增加了肿瘤细胞活力，抑制了细胞凋亡，对未处理的细胞存活影响不大（图1C和D）。NIT2过表达（图1F）增加了5-FU处理的效果。表明NIT2使GC细胞对5-FU敏感（图1G）。为了验证NIT2在体内化疗耐药中的作用，用表达shNT、shNIT2和用rNIT2 WT或rNIT2 ED重组shNIT2的MKN45或AGS细胞建立裸鼠皮下异种移植模型，与体外结果一致（图1L和M）。Kaplan-Meier生存分析显示，NIT2低表达的胃癌患者的OS率低于NIT2高表达的胃癌患者（图1Q）。总之，结果表明NIT2是一种化学敏感蛋白，可能有助于克服5-FU耐药性。

图1 NIT2作为5-FU化学敏感蛋白介导胃癌5-FU耐药

2、NIT2通过还原H3K14ac抑制OXPHOS
为研究NIT2缺失支持5-FU处理下细胞存活的机制，对暴露于5-FU下表达shNT和shNIT2的MKN45细胞进行RNA-seq分析。富集分析显示，在5-FU处理下，NIT2敲低后OXPHOS通路的上调显著富集。LC-MS分析显示，5-FU处理后，NIT2缺失细胞中二磷酸腺苷(ADP)/三磷酸腺苷（ATP）比值降低（图2B）。为了验证NIT2通过抑制OXPHOS增加5-FU敏感性，在5-FU暴露后用二甲双胍（一种OXPHOS抑制剂）处理NIT2缺失的细胞。NIT2过表达和二甲双胍处理均提高了5-FU的治疗效率，如OCR和细胞活力的降低（（图2D-F）。结果表明，NIT2在5-FU处理下抑制了OXPHOS基因的表达。
用表达shNT或shNIT2的MKN45细胞在5-FU处理后进行了ATAC-seq测定。NIT2敲低显著促进了染色质的可及性，包括NDUFA13和COX20（图2I）。NIT2敲低显示H3K14ac显著增加，但在H3K9ac、H3K27ac和H3K36ac中没有增加（图2J）。为了确定NIT2缺失后H3K14ac的直接靶点，进行了ChIP-seq分析，联合RNA-seq数据分析显示，在NIT2-缺失细胞中，H3K14ac富集于NDUFA13和COX20位点（图2N、O）。这些结果表明，NIT2通过降低H3K14ac来抑制OXPHOS。

图2 NIT2通过降低H3K14ac抑制OXPHOS基因表达

3、NIT2通过减少BRD1的相分离来抑制HBO1介导的H3K14ac修饰
为了研究NIT2如何调控H3K14ac修饰，对NIT2相关蛋白进行质谱分析，并鉴定出与H3K14ac相关的BRD1。Co-IP验证了5-FU处理降低了NIT2和BRD1之间的相互作用（图3A-D）。生成了四个BRD1截断片段（图3I），结果表明BRD1的PHD结构域互作更强（图3F）。NIT2过表达抑制了BRD1与H3的结合，且抑制程度与NIT2过表达程度呈正相关（图3H），而缺乏PHD结构域的BRD1-∆PHD突变体几乎不与H3相互作用（图3G）。
对HBO1/BRD1/H3和HBO1/BRD1/H3/NIT2配合物进行了分子动力学模拟和结合自由能计算（图3I、J），表明NIT2通过改变HBO1上的H3结合域来减少HBO1和H3的结合。NIT2的结合减弱了HBO1和H3之间的相互作用。构建了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-BRD1质粒来检测BRD1的相分离，表明BRD1可以进行相分离（图3L）这些结果表明，当NIT2靶向HBO1复合体时，HAT活性和H3K14ac降低，从而抑制OXPHOS基因的表达，而NIT2缺失后，这种情况发生逆转（图3O）。结果表明，NIT2结合BRD1抑制HBO1复合物介导的H3K14ac修饰，从而抑制OXPHOS。

图3 NIT2通过结合BRD1抑制HBO1介导的H3K14ac修饰

4、Src介导的NIT2 Y49磷酸化将NIT2与BRD1分离，并稳定RELA
为了研究5-FU处理后NIT2与BRD1复合物解离的机制，将NIT2的磷酸化位点突变为丙氨酸(A)。Co-IP测定，5-FU处理后，NIT2 Y49A与BRD1复合物相互作用（图4B）。NIT2 Y49磷酸化（NIT2 pY49）导致BRD1与NIT2之间的相互作用的减少（图4C）。相反，NIT2 Y49A突变，模拟Y49的组成性去磷酸化，在5-FU处理下抑制EGFP-BRD1核点的形成并抑制HAT活性（图4、E和F）。5-FU诱导Src在Y49位点磷酸化NIT2（图4G-I）。

NIT2缺失增加了RELA蛋白的表达，但不影响其mRNA的表达（图4J）。5-FU处理后，细胞核中RELA的表达增加，细胞质中RELA的表达减少。与rNIT2 WT相比，5-FU处理后，rNIT2 Y49A对RELA降解的促进作用在ING4敲除后被抑制，表明RELA降解依赖于ING4（图4K）。ChIP-seq显示在5-FU处理下，NIT2 Y49A减少了RELA对NDUFA13和cox-20启动子的募集（图4M）。综上所述，表明5-FU诱导Src介导的NIT2在Y49位点磷酸化，促进其与HBO1复合物的分离，然后增强HBO1复合物与H3之间的相互作用，从而抑制ING4介导的RELA降解。

图4 Src调控的NIT2 Y49磷酸化将NIT2与BRD1分离，并稳定RELA

5、NIT2在5-FU介导的磷酸化过程中发生自噬降解
NIT2表达在5-FU耐药样本中明显较低（图5A），但mRNA表达没有改变（图5B）。5-FU处理后，蛋白酶体抑制剂MG132的刺激对NIT2蛋白的影响很小（图5D）。此外，在5-FU处理的ATG5 KO自噬缺陷细胞中，NIT2降解率明显受到抑制（图5E）。LC3是自噬的标记蛋白，发现5-FU处理后NIT2与LC3结合（图5F），增加了NIT2和LC3的共定位。为了确定负责NIT2降解的货物受体，对已知的货物受体与NIT2进行了Co-IP，结果显示只有p62与NIT2结合（图5G）。5-FU处理促进了p62与NIT2之间的相互作用（图5G）。结果表明，5-FU刺激促进了NIT2的自噬降解。5-FU处理后，NIT2 Y49A的表达得以维持（图5H），这可能是因为与NIT2 WT相比，NIT2 Y49A几乎不与LC3和p62相互作用（图5，I和J）。总之NIT2 Y49的磷酸化是NIT2蛋白不稳定的关键。

图5 5-FU诱导NIT2自噬降解

6、CCNB1IP1促进NIT2 K60残基的泛素化
由于货物受体p62识别泛素化蛋白靶点，发现在5-FU处理下，NIT2泛素化增加（图6A）。NIT2 Y49A的泛素化保持不变（图6B）。质谱分析确定5-FU调控的NIT2泛素化位点，4个潜在的泛素化残基，K52、K60、K68和K249。在5-FU处理后，只有NIT2 K60R突变体的表达几乎保持不变（图6C）。5-FU诱导了NIT2 WT的降解，但对NIT2 K60R的影响很小（图6D），而NIT2 K60R则降低了NIT2泛素化的增加（图6E）。与NIT2 WT相比，在5-FU条件下，NIT2 K60R显著抑制H3K14ac（图6H）。因此，与NIT2 WT相比，NIT2 K60R抑制OXPHOS，提高5-FU的化疗效果（图6I）。
构建了E3连接酶的CRISPR文库（图6J），发现在CCNB1IP1、ARIH1和RFWD2中，只有CCNB1IP1敲低增加了NIT2的稳定性，而在5-FU处理下，CCNB1IP1过表达降低了NIT2的丰度（图6L）。在GC患者样本中进一步证实了NIT2与CCNB1IP1蛋白表达的反向关系（图60）。这些结果表明，E3连接酶CCNB1IP1参与了5-FU诱导的K60位点NIT2泛素化。

图6 在5-FU处理下，NIT2泛素化需要CCNB1IP1

7、NIT2在体内促进5-FU化疗
为了确定胃癌中NIT2与5-FU耐药性的临床相关性，发现H3K14ac、NDUFA13、COX20和CCNB1IP1在低NIT2组中高表达（图7A），与NIT2呈负相关（图7B）。在患者来源的异种移植（PDX）模型中检测了5-FU的功效（图7D）。与低NIT2表达的PDX相比，5-FU对高NIT2表达的PDX表现出更大的治疗效果，并且在低NIT2表达的PDX中，5-FU与二甲双胍联合治疗效率提高（图7E、F）。在低NIT2的PDXs中，OXPHOS基因的表达和H3K14ac的程度更高，表明对5-FU具有抗性（图7I）。与NIT2 WT相比，NIT2 Y49A促进了5-FU的治疗效果，而疗效与5-FU和二甲双胍联合治疗NIT2 WT肿瘤的疗效大致一致（图7J、K）。这些结果表明，Y49位点的NIT2磷酸化促进了体内5-FU的抗性。

图7 NIT2在体内促进5-FU化疗

三、研究结论
NIT2的缺失或低表达导致5-FU耐药。NIT2与BRD1相互作用，抑制HBO1介导的H3K14ac乙酰化和RELA靶向氧化磷酸化（OXPHOS）基因表达。在5-FU刺激下，Src在Y49位点磷酸化NIT2，促进了NIT2与BRD1的解离，随后与E3连接酶CCNB1IP1结合，引起NIT2的自噬降解。NIT2的表达与H3K14ac和OXPHOS呈负相关，与胃癌患者的化疗反应和预后呈正相关。二甲双胍诱导的OXPHOS阻断增加了低NIT2表达的GC肿瘤患者5-FU的化学敏感性。

参考文献：
NIT2 dampens BRD1 phase separation and restrains oxidative phosphorylation to enhance chemosensitivity in gastric cancer.[J]Science Translational Medicine, 2024.