2023年发表于《Nature Communications》（IF=14.7）

一、研究背景
CD4⁺辅助性T细胞谱系的极化是由特定的信号转导、局部细胞因子和转录因子调控的。表观遗传因素，如组蛋白修饰和DNA甲基化，通过介导特定转录因子和细胞因子的表达参与不同Th细胞系的分化。RNA修饰已被证明参与多种T细胞免疫过程中，它是否直接调控Th17细胞功能的维持尚未被研究。Th17细胞是一类促炎CD4⁺ T细胞，分泌IL-17A、IL-17F等细胞因子，主要参与炎症反应和多种自身免疫性疾病。视黄酸孤儿受体RoRγt是调控Th17细胞分化的关键转录因子。Th17细胞命运决定的潜在机制仍不清楚。

二、研究结果
1、Nsun2对Th17细胞的稳态至关重要

构建了Nsun2敲除（Nsun2^−/−）小鼠模型，Nsun2的缺失特异性地抑制了脾脏、PBMCs和淋巴结中IL-17A⁺ Th17细胞的百分比（图1c，d），只有Th17细胞在Nsun2缺失后被特异性抑制。构建了T细胞特异性Nsun2缺失的小鼠。与在全局Nsun2敲除小鼠中观察到的表型一致（图1c，d），T细胞异性敲除Nsun2确实阻碍了体外Th17细胞的分化（图1e，f）。由于RoRγt是Th17细胞的谱系转录因子，Nsun2不影响Th17细胞中RoRγt的表达（图1g）。用地高辛阻断RoRγt，发现Th17细胞的体外分化被显著抑制。在Nsun2基因敲除的背景下，抑制RoRγt并没有导致Th17细胞分化进一步减少（图1i）。因此，假设Nsun2和RoRγt在同一信号轴上坐标以控制Th17谱系。

图1 Nsun2对Th17的稳态至关重要

2、Nsun2直接与RoRγt相互作用

转录因子RoRγt在Th17细胞中与Nsun2内在相互作用的候选蛋白中排名第一，与Nsun2有强烈的相互作用（图2a）。Co-IP和体外GST-pull-down证实了Nsun2和RoRγt之间的直接相互作用（图2b，c）。PLA和免疫荧光显示Nsun2与细胞核中的RoRγt相互作用（图2d）。ATAC-seq测定了染色质可及性的变化，结合野生型Th17细胞的公开RoRγt ChIP-seq数据，发现RoRγt结合与Th17细胞中发现的开放染色质区域相关。Nsun2不影响RoRγt的染色质结合效率，也不影响caRNA的丰度。总之，尽管Nsun2缺失与转录因子RoRγt直接相关，Nsun2缺失对其染色质可及性和整体基因转录没有影响。

图2 Nsun2与RoRγt结合，促进Th17相关基因上的m5C形成

3、Nsun2与RoRγt结合，催化RNA m5C的形成

Nsun2是一种m5C甲基转移酶，推测Nsun2可能被募集到RoRγt靶点上，促进m5C的形成。Nsun2的RIP-seq和m5C的MeRIP-seq，81.1%的Nsun2结合基因被m5C修饰，并且在其基因体区域上也被RoRγt优先靶向(图2f）。RoRγt的启动子结合效率与Nsun2和m5C对靶基因的富集成正比（图2g，h）。发现56.6%的RoRγt靶标被Nsun2占据，并被m5C修饰（图2i）。GO富集分析表明，这些基因在细胞内信号转导和T细胞受体信号通路中显著富集（图2j）。Th17特异性RNA，如Il17a和Il17f，这两个基因的染色质相关RNA（caRNAs）在Th17细胞中同时被Nsun2和RoRγt结合（图2k，1）。此外，m5C MeRIP-qPCR显示，Il17a和Il17f RNA也被m5C修饰（图2m，n）。综上所述，Nsun2与RoRγt结合，通过直接甲基化Th17特异性转录物来控制Th17细胞功能稳态；而RoRγt的染色质可及性和整体转录起始不受这一过程的影响。

图2 Nsun2与RoRγt结合，促进Th17相关基因上的m5C形成

4、Nsun2通过基于m5C的mRNA的稳定性来控制Th17的稳态

对野生型和缺乏Nsun2的Th17细胞的进行了RNA-seq，40%的下调基因是Nsun2靶向的，并被m5C修饰。构建了野生型Nsun2-WT和突变型的Nsun2（Nsun2-c321a）（图3c）。过表达Nsun2可以挽救Th17细胞中Il17a和Il17f mRNA水平的下降（图3d）。野生型Nsun2也挽救了Nsun2cKO中IL-17A⁺ Th17细胞的减少（图3e，f）。这些发现表明，Nsun2固有的甲基转移酶活性对于Th17细胞的产生和功能维持至关重要。Nsun2的缺失显著加速了Il17a和Il17f mRNA的降解（图3g）。合成了两个迷你基因报告基因：Il17a-C（未修饰C）和Il17a-m5C（图3h），Il17a-m5C报告RNA比Il17a-C报告RNA更稳定。综上所述，Nsun2通过调节依赖于m5C修饰的关键细胞因子mRNA的稳定性来维持Th17细胞的稳态。

图3 Nsun2通过m5C介导的mRNA稳定性控制Th17细胞的生成

5、在T细胞中靶向Nsun2可改善结肠炎的发展

Th17细胞大量浸润炎症肠道，分泌IL-17A促炎细胞因子募集新嗜细胞，从而在炎症性肠病（IBD）患者中触发和放大炎症发病机制。在Nsun2^−/−和野生型的幼崽中用DSS诱导结肠炎疾病，Nsun2^−/−小鼠结肠炎的发展受到限制。T细胞中Nsun2特异性缺失也减轻了结肠炎的发生（图4a-c）。与对照小鼠相比，Nsun2^cKO小鼠中Th17细胞的频率显著降低（图4d），而Th1、Th2和Treg细胞的频率较小或不变（图4e-g），Nsun2^cKO小鼠结肠中Th17细胞浸润减少（图4h，i），表明靶向T细胞中的Nsun2通过抑制Th17细胞功能减轻结肠炎的进展。Nsun2^cKO小鼠显著减少了受体小鼠肠道固有层中Th17细胞的浸润，没有出现结肠炎特征（图4j，k）。特异性抗体阻断IL-17A或IL-17A和IL-17F可保护受体小鼠免于结肠炎的发展，总的来说，这些数据支持靶向T细胞中的Nsun2改善结肠炎的发展。

图4 在T细胞中靶向Nsun2可改善Th17介导的自身免疫

6、在结肠炎进展期间Nsun2靶向IL-17A/IL-17F

阻断IL-17A、IL-17F或两者均可显著缓解DSS诱导的野生型小鼠结肠炎的发展，同时阻断两者的效果更明显。相反，通过注射重组小鼠IL-17A、IL-17F或两者同时注射，可以逆转DSS诱导的Nsun2^cKO小鼠结肠炎进展的缓解（图5a-f）。总之，表明IL-17A和IL-17F都是Th17细胞中Nsun2的下游靶点，并参与结肠炎的进展。

图5 在DSS诱导的Nsun2^cKO小鼠中，补充rIL-17A/rIL-17F可逆转结肠炎的发展

7、Nsun2缺失可逆转IL-17R+细胞的病理改变

为了揭示Nsun2在结肠炎微环境中的调控途径，对野生型和Nsun2^cKO小鼠的结肠进行了单细胞RNA-seq分析。单细胞谱被划分为15个亚群，细胞计数从66到5253（图6a，b），其中上皮细胞（24.4%）和B细胞（25.8%）是富集程度最高的两个亚群。在野生型组中，发现15种细胞类型中有9种在结肠炎期间发生了异常变化，这些异常变化大部分可以通过Nsun2耗竭来逆转（图6c）。所有获救的细胞类型都表达IL-17受体（图6d）。这些结果表明，T细胞特异性Nsun2的缺失，通过优先逆转表达IL-17受体的细胞的病理改变，从而阻碍结肠炎的发展。

图6 Nsun2缺失通过破坏Th17细胞与IL-17受体表达细胞之间的细胞间通信来减轻结肠炎的发展

三、研究结论
小鼠CD4⁺ T细胞中甲基转移酶Nsun2的缺失特异性抑制Th17细胞分化并减轻Th17细胞诱导的结肠炎发病机制。RoRγt可以将Nsun2招募到其靶标的染色质区域，包括Il17a和Il17f，导致转录偶联m5C的形成，从而增强mRNA的稳定性；Nsun2是自身免疫性疾病的潜在治疗靶点。

参考文献：
Nsun2 coupling with RoRγt shapes the fate of Th17 cells and promotes colitis.[J]Nature Communications, 2023.