2023年发表于《Journal for Immunotherapy of Cancer》（IF=10.3）

一、研究背景
免疫检查点抑制剂（ICIs）主要包括PD-1、PD-L1和CTLA-4。SETD2是唯一的组蛋白甲基转移酶，通过H3K36me3发挥关键作用。SETD2基因突变在约5%的人类癌症中普遍存在，并促进肿瘤的进展。目前还没有开发出专门针对SETD2缺陷肿瘤并显示出治疗潜力的小分子或抗体。TCGA数据集数据分析表明，SETD2突变可能与ICI免疫治疗的疗效相关，而SETD2失活的功能重要性以及如何调节免疫治疗反应仍不清楚。

二、研究结果
1、在同基因小鼠模型中敲除Setd2，使肿瘤对ICIs免疫治疗敏感
SETD2编码一种组蛋白H3K36三甲基转移酶，建立了一种同源小鼠胰腺腺癌细胞系，即KC细胞，利用CRISPR/Cas9构建Setd2-敲除（KO）KC细胞（图1A），使用抗PD-L1抗体作为ICI。与对照相比，抗PD-L1治疗显著降低了KC-sgSetd2肿瘤的生长，但对KC-对照肿瘤没有影响（图1B-E）。结果表明，Setd2敲除可使胰腺腺癌对抗PD-L1免疫治疗增敏。在小鼠黑色素瘤细胞系（B16F10）进了了进一步验证（图1F），敲低Setd2并没有明显减缓细胞增殖，但对免疫正常小鼠的抗PD-L1治疗效果有显著影响（图1G、H和I）。抗PD-L1治疗对对照B16F10肿瘤无效（图1I、J）。表明肿瘤中Setd2失活使KC胰腺腺癌和B16F10黑色素瘤对免疫检查点阻断敏感。

图1 Setd2敲除使小鼠肿瘤对抗pd-l1免疫治疗敏感

2、SETD2失活通过上调Stat1来激活IFNγ通路
对KC-KO/KC-WT同种异体移植肿瘤和KC-sgSetd2/ KC对照细胞进行了RNA-seq。GSEA显示，在KC-KO肿瘤和KC-sgSetd2细胞中，调节免疫反应、细胞因子产生、干扰素-γ(IFNγ)反应、抗原加工和递呈的基因集均显著上调（图2A）。IFNγ通路在肿瘤对免疫治疗的反应中起着关键作用，IFNγ通路中的关键转录因子STAT1在KC-KO肿瘤和KC-sgSetd2细胞中被显著上调和激活（图2B、C）；western blotting和RT-qPCR进行了证实（图2D，E）。在体外（图2F、G）和体内（图2H）敲低SETD2，上调IFNγ诱导的趋化因子基因Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11。这些结果表明Setd2失活增加STAT1的表达和激活，进而激活IFNγ通路，从而促进免疫相关基因的表达和免疫相关通路的激活。

图2 Setd2失活诱导了STAT1的表达和激活

3、SETD2的缺失促进了PD-L1的表达和抗原呈递
IFNγ-JAK-STAT1轴是PD-L1表达和MHC-I抗原加工和递呈的重要途径，发现在Setd2缺失模型中，IFNγ-STAT1通路激活后PD-L1表达和抗原呈递增强。RT-qPCR证实了Pdl1的上调（图3A、B）。流式细胞术分析显示，细胞膜上PD-L1蛋白表达增加（图3C、D）。综合GSEA结果，发现Setd2缺失促进了MHC-I抗原的加工和提呈。在Setd2-KO KC细胞中组成性表达OVA，证实了sgSetd2-OVA细胞表面SIINFEKL-H-2Kb水平上调（图3G）。体外和体内实验均表明，Setd2缺乏使KC细胞对CD8+ OT-1细胞介导的杀伤效应变得敏感（图3H）。综合结果可知，Setd2缺陷通过上调Stat1激活IFNγ通路，并进一步增加Pdl1表达、IFNγ诱导的趋化因子基因表达和MHC-I抗原呈递，从而协同提高抗PD-L1免疫治疗的效果。

图3 Setd2失活促进IFNγ-stat1诱导的PD-L1表达和MHC-I抗原呈递

4、SETD2失活通过下调Nr2f1来促进Stat1的表达
SETD2是唯一负责H3K36me3三甲基化的酶，KC-KO和KC-WT中进行ChIP-seq看H3K36me3在细胞中的分布。KC-ctrl和KC-sgSetd2细胞中ATAC-seq表明，SETD2的缺失导致染色质可及性的全基因组改变。Nr2f1是下调最显著的转录因子，在Setd2失活细胞中该基因位置的H3K36me3富集和染色质可及性呈一致的下降趋势（图4A、B）。将NR2F1慢病毒转导至Setd2敲除细胞和对照细胞（图4C），Stat1 mRNA水平和蛋白水平均降低（图4D）。构建Flag-Nr2f1的ChIP-qPCR，证实了NR2F1与Stat1启动子结合（图4F）。GFP实验也得到了相似结果（图4G，H）。结果表明，Setd2缺失通过减少NR2F1基因体上的H3K36me3沉积和减少NR2F1启动子区域近端的染色质可及性来破坏NR2F1的转录，从而进一步以负反馈的方式增加Stat1的表达和激活。

图4 Setd2失活通过下调Nr2f1的表达来诱导STAT1的表达和激活

5、SETD2缺失可重新编程肿瘤免疫微环境
对KC-KO（Setd2）和KC-WT KC细胞进行RNA-seq，ssGSEA和ESTIMATE分析显示KC-KO肿瘤的免疫细胞浸润明显高于KC-WT肿瘤（图5A）。scRNA-seq分析显示，Setd2缺陷肿瘤中浸润的T细胞、NK等细胞比例显著增加，而浸润的巨噬细胞比例显著降低(图5C、D)。M2样巨噬细胞的比例显著减少（图5E、F）。这些结果表明，Setd2缺失通过减少M2巨噬细胞浸润和增加效应T细胞浸润来炎症肿瘤微环境（TME）。轨迹分析表明，在接受抗PD-L1免疫治疗的KC-sgSetd2肿瘤中，细胞毒性CD8+ T细胞的比例显著增加（图5I、J）；CD3⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的浸润增加（图5K、L）。这些发现在人类TCGA透明细胞肾细胞癌（ccRCC）队列中得到了验证。Setd2缺失导致的TME炎症有助于抗PD-L1治疗，并且细胞毒性CD8⁺ T细胞在免疫治疗中发挥主要作用。

图5 肿瘤内免疫浸润的bulk RNA-seq和scRNA-seq

6、人类癌症中的SETD2-NR2F1-STAT1轴
为证实SETD2失活对STAT1的抑制依赖于NR2F1，在胰腺导管腺癌细胞系YAPC用sgRNA敲除SETD2（图6A）。STAT1在mRNA和蛋白水平上调，STAT1激活介导的CXCL10和PDL1也上调（图6A、B）。转录组分结果显示，YAPC-sgSetd2与KC-sgSetd2细胞基因特征相似（图6C、D）。ICGC胰腺癌队列的公共数据集分析显示SETD2与STAT1表达，NR2F1与STAT1表达，SETD2与PDL1表达呈负相关（图6E、F）。非配对比较显示，在SETD2高表达的肿瘤中，STAT1和PDL1的表达较低（图6G），而在NR2F1低表达的肿瘤中，STAT1的表达显著升高（图6G）。最后，对75例胰腺导管腺癌患者进行了IHC，证实了SETD2和NR2F1的表达显著正相关（图6H、I）。
NR2F1与STAT1、SETD2以及免疫抑制基因CTLA-4、IDO1、HAVCR2、LAG3的表达呈负相关（图6J），SETD2与NR2F1的表达呈正相关（图6K）。SETD2-高的肿瘤中NR2F1 mRNA水平明显高于SETD2-低和SETD2-缺失的肿瘤（图6L）。这些结果表明SETD2-NR2F1-STAT1调控的机制在人类癌细胞系和患者样本中是高度保守的，突出了SETD2缺乏在ICIs免疫治疗人类癌症疗效中的作用。

图6 SETD2-NR2F1-STAT1轴在人ccRCC和胰腺癌中的作用

7、携带SETD2突变的癌症患者受益于ICIs免疫治疗
检索并分析了MSK-IMPACT中接受ICIs（抗PD-1/PD-L1/CTLA-4）治疗的1662例晚期癌症患者的基因组和临床结局数据。476个癌基因中，127个基因与免疫治疗的有益效果相关（p<0.05）。排名靠前的基因包括已知的ICIs治疗预测性生物标志物，包括TP53、PAK7、TET1、PTPRD/PTPRT和STK11。SETD2在476个基因中名列前三。SETD2失活突变的患者在免疫治疗中有更有利的结果（图7A、B），这与先前的报道一致，这一结果通过黑色素瘤（图7C、D）和非小细胞肺癌队列进行了验证。

图7 癌症SETD2突变的患者受益于免疫检查点抑制剂（ICIs）免疫治疗

三、研究结论
ETD2失活通过减少NR2F1转录，从而激活STAT1信号通路，促进趋化因子和PD-1的表达并增强抗原提呈，增强免疫效果。携带SETD2突变的癌症患者接受了ICIs，显示出持久的临床获益和生存率增加。

参考文献：
Tumor cell-intrinsic SETD2 inactivation sensitizes cancer cells to immune checkpoint blockade through the NR2F1-STAT1 pathway.[J]Journal for Immunotherapy of Cancer, 2023.