2024年发表于《International Journal of Biological Sciences》（IF=8.2）

一、研究背景
代谢性相关脂肪性肝病(MAFLD)，又称非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，是一种多因素诱发的慢性肝病，目前尚无针对MAFLD的批准治疗策略。在MAFLD的发展过程中，STAT3在肝脏中被激活就会磷酸化(P-STAT3)，通过P-STAT3的二聚化转运到细胞核，并作为转录因子调节基因表达。

二、研究结果
1、HFD损害糖脂代谢，诱导慢性炎症
图1A为HFD诱导的MAFLD模型。与对照组(CON)相比，HFD组小鼠体重增加(图1B-C)。肝脏体积和肝脏重量/胫骨长比增加(图1B、D)，脂滴积累增加(图1E)；随机血糖和空腹血糖水平均升高(图1G-H)。OGTT和ITT结果显示HFD诱导糖耐量和胰岛素惯性异常(图1I-J)。肝组织中的典型胰岛素通路保持不变，但HFD导致GLUT4膜运输缺陷(图1K)。HFD组小鼠肝脏中IL-6等活化炎性因子mRNA水平升高，血清中IL-6分泌水平升高(图1L-M)。已知IL-6/STAT3信号通路在许多慢性炎症性疾病中异常高激活。本研究中，STAT3在HFD组的肝组织中被激活(图1N)。这些结果提示肝脏炎症可能在MAFLD的发展过程中被激活。

图1 HFD损害糖脂代谢，诱导慢性炎症

2、Ox-LDL在MAFLD的发展过程中诱导了STAT3的激活，导致GLUT4运输缺陷和体外胆固醇积累
体外采用ox-LDL建立了MAFLD模型。ox-LDL抑制胰岛素诱导的GLUT4膜易位，与CON组相比，细胞质中GLUT4较多，膜中GLUT4较少(图2B)。免疫荧光结果也表明GLUT4膜易位缺陷(图2C)。ox-LDL诱导了肝细胞中的胆固醇积累(图2D)。此外，ox-LDL刺激L02细胞IL-6分泌和mRNA均显著增加，并且STAT3也被活化。使用IL-6处理L02细胞后，检测到STAT3的激活，诱导葡萄糖摄取受损和GLUT4膜易位异常，与ox-LDL组相似。使用siRNA敲低STAT3导致胆固醇积累减轻(图2D)，STAT3过表达加剧了胆固醇的过度积累(图2E)，进一步验证了ox-LDL诱导的肝脏胆固醇紊乱是由于STAT3的激活。

图2 Ox-LDL在MAFLD的发展过程中诱导STAT3的激活，导致GLUT4交通缺陷和体外胆固醇积累

3、VAV3可能参与了STAT3调控的MAFLD的发展
STAT3是一种转录因子，我们在肝组织中进行ChIP-seq，寻找STAT3转录调控的参与调节肝脏糖脂代谢的基因。筛选了63个基因，重点关注糖脂代谢和GLUT4储存囊泡的调节(图3A)。根据ChIP-seq的结果和来自JASPAR数据库的预测，VAV3被发现受STAT3调控，并且根据GO和KEGG数据库，VAV3作为一种GEF蛋白与代谢相关，可以激活Rho gtpase来调节GLUT4的运输。从VAV3的注释峰可以看出，VAV3可能受到STAT3的转录调控(图3E)。根据ChIP-seq和JASPAR数据库，通过WB和IHC验证HFD组肝组织中VAV3表达降低，P-STAT3表达升高(图3F-G)。这些结果表明，VAV3可能受STAT3调控，参与GLUT4易位，促进MAFLD的发生。

图3 VAV3可能参与了STAT3调控的MAFLD的发展

4、过度激活STAT3可抑制VAV3的表达
根据ChIP-seq分析，探讨STAT3是否通过抑制VAV3的表达来调控MAFLD的发展。敲低STAT3的siRNA以及特异性磷酸化STAT3的抑制剂statstatic对ox-LDL刺激后的L02细胞进行干预。当P-STAT3减少时，VAV3的表达相应增加(图4A-B)。IL-6刺激后，VAV3表达降低，而P-STAT3呈时间依赖性升高(图4C)。此外，siRNA敲低STAT3和过表达STAT3验证了STAT3对VAV3的负调控(图4D-E)。

图4 过度激活STAT3可抑制VAV3的表达

5、VAV3缺失可导致GLUT4易位缺陷和胆固醇积累
为了确定VAV3在调节葡萄糖和胆固醇积累中发挥关键作用，使用siRNA和shRNA慢病毒载体敲低VAV3，qPCR和western blotting检测VAV3的敲低效率。观察到由VAV3缺陷引起的GLUT4膜易位缺陷(图5A-C)，肝脏VAV3缺乏导致细胞内胆固醇积累(图5D-E)。VAV3缺陷也增加了NF-kB的表达，这可能导致其他细胞损伤，需要进一步探索(图5D)。然而，在ox-LDL刺激下，采用VAV3过表达可减轻细胞内胆固醇积累(图5F-G)。

图5 VAV3缺失可导致GLUT4易位缺陷和胆固醇积累

6、恢复VAV3的表达可以减弱MAFLD在体内的发展
建立小鼠MAFLD模型，在AAV组HFD下使用rAAV-TBG-VAV3进行肝脏特异性过表达(图6A)。在12周的喂养期间，随机和空腹血糖水平的测量显示，与HFD组相比，AAV组的糖代谢紊乱有显著改善(图6B-C)。此外，OGTT和ITT结果表明，在HFD下，VAV3的过表达改善了HFD组的葡萄糖稳态和胰岛素敏感性受损(图6D-E)。肝脏过表达VAV3也可以减轻HFD引起的体重和肝脏大小的增加，如体重记录、毛重图片和体重/胫骨长比(补充图6B，图6F-G)。此外，肝脏超声结果证实HFD组存在脂肪性肝病，如蓝色箭头所示，与CON组相比有强光区，而AAV组表现较轻(补充图6C)。与HFD组相比，AAV组血清TG、TC、LDL水平均降低，HDL水平升高，表明VAV3过表达可改善MAFLD的脂质代谢(图6H)。此外，油红O染色显示AAV组的脂滴积累少于HFD组，而免疫组化染色证实AAV组肝脏特异性过表达VAV3(图6I-J，补充图6D)。qPCR和western blotting结果显示，与HFD组相比，AAV组在HFD下VAV3过表达减轻了体内胆固醇在细胞内的积聚(图6K-L)。ELISA结果还显示，AAV组血清IL-6水平低于HFD组，qPCR提示AAV可通过恢复HFD下VAV3的表达来抑制肝组织中多种炎症因子(图6M-N)。综上所述，恢复肝脏中VAV3的表达不仅可以减少糖脂异常，还可以抑制肝脏炎症，最终改善MAFLD的发展。

图6 恢复VAV3的表达可以减弱MAFLD在体内的发展

图7 STAT3/VAV3轴参与的MAFLD的发展机制

三、研究结论

STAT3/VAV3信号通路可能通过调节葡萄糖和胆固醇代谢在MAFLD中发挥重要作用，VAV3可能是一种潜在的治疗策略，从而改善MAFLD。

参考文献：
The role of STAT3/VAV3 in glucolipid metabolism during the development of HFD-induced MAFLD.[J]International Journal of Biological Sciences, 2024.