2023年发表于《Advanced Science》（IF=14.3）

研究思路：

KDM7A调节小鼠神经元中的IEGs的模型

一、研究背景
中枢神经系统的神经元丧失会导致认知功能障碍，产生神经退行性疾病。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)作为治疗神经退行性疾病的潜在靶点已经研究了很长时间，因此迫切需要寻找新的表观遗传靶点。KDM7家族由三个成员组成:KIAA1718(KDM7A)，PHF8(KDM7B)和PHF2(KDM7C)。作为一种去甲基化酶，KDM7A主要负责去除组蛋白上的H3K9me1/2和H3K27me1/2；KDM7A在哺乳动物神经系统中的调控机制尚不清楚。即时早期基因(Immediate early genes，简称IEGs)在外界刺激下快速而短暂地表达，因此，它们被广泛用作神经元活动的标记物。

二、研究结果
1、KDM7A在神经元细胞分化过程中表达增加
Neuro-2a(N2a)是一种小鼠神经嵴来源的细胞系，作为体外模型。诱导N2a细胞分化，细胞体直径1.5倍的细胞定义为分化细胞(图1b)。诱导4天后，KDM7A表达在N2a分化过程中呈时间依赖性增加(图1c)。分化后，KDM7A在mRNA和蛋白水平上的表达均显著增加(图1c-e)。在N2a分化过程中，发现Mtap2和Syp)以时间依赖的方式增加(图1f,g)，表明诱导系统成功。因此，在随后的分析中，Mtap2和Syp被用来评估N2a细胞的分化进程。

图1 KDM7A在神经元细胞分化过程中增加

2、KDM7A是神经元细胞分化的关键因素
为了评估KDM7A在N2a分化中的作用，用两种shRNA慢病毒敲低了Kdm7a。在mRNA和蛋白水平上检测了敲低效率(图2a-c)。shKdm7a N2a细胞的分化率明显降低(图2g)。Mtap2和Syp mRNA水平在shKDM7A N2a细胞中也降低(图2h)，提示shKdm7a抑制了N2a细胞的分化。过表达Kdm7a(图2i)，发现N2a细胞的分化明显促进(图2j-1)。这些结果提示KDM7A在神经元细胞分化中的重要作用。神经元标记物Tuj-1免疫荧光染色显示，对照组标记细胞开始向皮层迁移分化，而敲低组细胞在脑室壁(图2n、o)。这突出了KDM7A在体内神经元细胞分化中的关键作用。

图2 KDM7A促进神经元细胞分化

3、KDM7A介导基因表达的潜在机制
ChIP-seq和CUT&Tag检测到KDM7A结合富集的相似区域(图3a)。两种CUT&Tag抗体检测到的一致峰，其中55.5%位于启动子上(图3b)。KDM7A与启动子结合的基因的表达水平明显高于其他基因(图3c)。KDM7A结合基序(图3d)中前10位基序中有5个序列相似，可与c-Jun、Fra2、Fra1、JunB和Atf3结合，均属于AP-1家族。
KDM7A是一种组蛋白去甲基化酶，可特异性地消除H3K9和H3K27的二甲基化，使用ChIP-seq和CUT&Tag检测Kdm7a敲低后TSS上六种组蛋白修饰的变化。结果表明，当Kdm7a敲低时，TSS时一些抑制性组蛋白修饰增加，活性组蛋白修饰减少，这可能有助于靶基因的调控。

图3 全基因组KDM7A结合及其对组蛋白修饰的影响

对shCtrl和shKdm7a N2a细胞进行RNA-seq分析。Kdm7a敲低后，差异基因主要富集于表达调控(图4c)。将DEG与启动子与KDM7A结合的基因整合。结果显示与KDM7A结合相关的上调和下调基因数量几乎相同（图4d、e），这表明KDM7A对基因调控的机制很复杂。差异基因的结合基序(图4f、g)分析显示，上调基因的顶部基序是抑制性转录因子Thap11，下调基因的顶部基序是活性转录因子Sp1。KDM7A峰位于Egr1和Atf3的启动子区。Kdm7a敲低使H3K9me2、H3K9me3、H3K27me2和H3K27me3水平升高，而在Egr1和Atf3的TSS处H3K27ac水平降低。过表达Kdm7a，不同程度的激活了这些IEGs(图41)。这些结果表明KDM7A可能通过调节TSS抑制或激活组蛋白修饰来介导IEG的表达。同时KDM7A可能与不同的TF协同激活或抑制其靶基因。

图4 KDM7A调控靶基因的表达

4、海马神经元中Kdm7a基因敲低会影响小鼠的认知和情绪行为
为研究小鼠大脑中KDM7A表达的改变是否会影响小鼠的认知和情绪行为。KDM7A在海马中的表达最高(图5a)。基于scRNA-seq数据集，发现Kdm7a在颗粒细胞(一种神经元)中的表达水平高于其他任何细胞类型(图5b,c)。小鼠脑切片中共免疫荧光检测结果显示，KDM7A主要在Tuj-1标记的神经元中表达(图5e)，这与scRNA-seq数据一致。通过神经元特异性腺相关病毒(AAV)立体定向注射敲除小鼠海马神经元中的Kdm7a(图5f,g)，成功敲除海马神经元中Kdm7a的表达(图5h-j)。

图5 小鼠大脑中Kdm7a的敲除

注射AAV后21 d进行行为学测试。与假小鼠相比，shKdm7a小鼠对探索新物体的兴趣较低，(图6f、g)，这表明短期记忆形成存在缺陷。海马区IEGs下调(图6h)，这与体外实验数据相关。c-Fos是研究最多的IEG，被广泛用作神经元活动的标记物。c-fos在shKdm7a小鼠的CA1区表达明显降低（图6i，j），这表明Kdm7a基因敲除后，神经元活性下降。

图6 KDM7A影响小鼠的神经元功能

三、研究结论
赖氨酸去甲基化酶KDM7A去除组蛋白修饰H3K9me1/2和H3K27me1/2，并可能与转录因子(TF)协同调节关键IEGs(如Egr1和Atf3)的表达。KDM7A的缺失会影响神经元细胞分化和小鼠神经元活动，导致情绪和记忆障碍。这可能为理解神经系统疾病的表观遗传机制提供新的线索。

参考文献：
The Lysine Demethylase KDM7A Regulates Immediate Early Genes in Neurons.[J]Advanced Science, 2023.