2024年发表于《Nucleic Acids Research》（IF=16.6）

一、研究背景
当环境条件发生剧烈和不利变化时，细胞会通过应激反应基因的转录重编程来调节RNA合成以适应变化。RNA结合蛋白(RBP)参与转录后调控，最近发现有一部分RBP在开放的染色质区域，如增强子和启动子，称为染色质相互作用RBP(ChRBP)。ChRBP的上游调控因子及其机制性质仍然具有挑战性和悬而未决的问题。circRNA(circRNAs)是一类单链和共价封闭转录本，可能调控染色质上ChRBP分布和功能活动，相关研究仍然非常有限。

二、研究结果
1、一类与gawky相互作用的circRNA的鉴定
假设某些circRNAs可能在ChRBP gawky蛋白介导的转录激活中充当上游调节因子，FLAGgawky稳定细胞系，铜应激细胞进行CLIP-seq(图1A)。19个circRNA与铜激活的gawky高度相关(图1B, C)。使用FIRE软件，发现MRE基序在gawky相互作用的circRNAs的RNA序列中比打乱的序列控制更丰富(图1D)。DEAD-box RNA解旋酶Hlc可以特异性地维持应激反应基因的基础转录，而不是应激诱导的转录，FLAGHlc细胞的CLIP-seq表明FLAG-Hlc对MRE circRNA的结合能力非常有限。MRE circRNAs不与非胁迫的gawky或胁迫的Hlc结合(图1G)，MRE circRNA-gawky相互作用的特异性。MRE circRNA同时存在于细胞核和细胞质部分(图1I)。表明MRE circRNA是一类应力响应型circRNA，在金属胁迫下特异性地与gawky相互作用。

图1 MRE circRNA的鉴定

2、MRE circRNA可以减弱应激诱导的转录
用circCG32369和circMCPH1载体构建MRE circRNA稳定细胞系(图2A)，并通过RT-qPCR确定过表达circCG32369或circMCPH1(图2B)。与正常的S2细胞相比，在铜胁迫下过表达MRE circRNAs的细胞，MT基因(一种特征明确的金属胁迫诱导基因)的mRNA水平被大幅下调(图2C)。在不含MRE的对照circRNA过表达时，MT的表达基本保持不变(图2F、G)。线性RNA稳定的细胞系中，应力诱导的MT表达没有改变(图2F, G)，可知MRE circRNA的线性状态不会导致MT下调。因此，这些数据排除了MRE circRNA可能通过调节其稳定性或核输出来调节MT表达的可能性。
NRO实验研究circCG32369和circMCPH1是否调节MT的转录活性，发现MT mRNA的新生转录物丰度显著降低(图2I)，支持MRE circRNA（circCG32369和circMCPH1），可以作为有效的转录抑制剂响应铜胁迫。MRE circRNA敲除证实，单个MRE circRNA的功能丧失不足以激发MT转录。

图2 MRE circRNA是应激诱导转录的有效抑制剂

3、MRE circRNA的功能活性需要gawky的存在
为了验证MRE circRNA介导的转录抑制是否在启动子区域是特异性结合，使用外显子mini-dati基因载体，加上MT启动子，并将其转入MRE circRNA稳定细胞中。硫酸铜胁迫细胞后，通过RT-qPCR发现，在两个MRE circRNA稳定细胞系中，mini-dati基因的表达水平被显著抑制，这与内源性MT的表型相似(图2C)。表明，MRE circRNA在转录中的准确作用依赖于启动子上下游。前述研究已知MRE circRNA特异性地与gawky相互作用(图1A-G，gawky通过启动子调控金属响应基因的转录激活，因此推断MRE circRNAs和gawky可能在一定程度上功能偶联。MRE circRNAs的过表达导致β-gal dsRNA(对照dsRNA)处理的细胞中MtnB mRNA水平显著降低(图3E)。相比之下，MRE circRNA无法抑制gawky-depletion细胞中的MtnB转录(图3E)。同样，在没有gawky的情况下，MRE circRNAs的过表达不再影响Pol II与MtnB的结合(图3F)。综上所述，gawky的存在是MRE circRNA抑制应激诱导转录的先决条件。

图3 MRE circRNA在gawky介导的转录中起作用

4、MRE circRNA调节gawky的分子作用
通过内源性gawky的抗体进行ChIP-seq，发现gawky与MtnB启动子之间存在强相互作用(图4A，灰线)。在稳定过表达MRE circRNAs的细胞中，gawky ChIP信号急剧减少(图4A，粉色和紫色线)，尽管检测到的gawky总表达水平没有显著差异(图4B、C)。表明MRE circRNAs损害了gawky向活性基因位点的募集。结合MTF-1 ChIP结果，证实了MRE circRNA介导的调控在胁迫诱导转录中的特异性。免疫荧光染色分析显示，在铜胁迫条件下，MRE circRNA可能在某种程度上作为gawky载体，有效地输出gawky和/或阻止gawky进入细胞核。综上所述，MRE circRNAs通过调节gawky的分子作用(即从应激反应基因中释放gawky并增强其细胞质积累)特异性地调节应激诱导的转录。

图4 MRE circRNA调节gawky的分子作用

5、MRE基序对于MRE circRNA在转录抑制中的准确功能具有重要意义
生成突变circCG32369载体构建稳定细胞系(图5A)，进行gawky CLIP-seq，与野生型相比，circCG32369突变体在铜胁迫下仅表现出有限的对gawky的结合能力(图5B)；且不是MRE突变后circCG32369丰度改变的结果(图5C)。发现表明circCG32369-gawky相互作用依赖于位于circRNA中的MREs。gawky的亚细胞定位，发现circCG32369在其MRE突变时诱导应激激活gawky的细胞质积累的能力大大受损(图5G、H)。因此，在MREs缺失后，circCG32369对铜诱导的MtnB转录的抑制作用减弱(图5I)。综上所述，数据证明位于MRE circRNAs中的MREs是circRNA-gawky相互作用的调控元件，这对于在应激条件下精确调控gawky介导的转录是必不可少的。

图5 MRE基序是MRE circRNA介导的转录抑制所必需的

6、铜胁迫时，MRE circRNA对数百个铜诱导基因有很强的调控能力
硫酸铜处理后，共有1627个基因的表达水平显著升高(图6A)，称为铜诱导基因。circCG32369过表达导致71.3%的差异表达基因被显著抑制(图6A)，具有强烈的全局抑制作用(图6B)，这意味着MRE circRNA对铜诱导基因群具有选择性。铜诱导基因对circCG32369介导的转录调控更为敏感，circCG32369更倾向于沉默诱导水平较高的基因(图6F、G)。高表达基因对circCG32369过表达的敏感性较低(图6N、O)。综上所述，MRE circRNA在抑制应激诱导转录中的广泛作用，并清楚地揭示了它们对应激诱导基因的选择性作用。敲低单个MRE circRNA不能促进应激诱导的转录，两种MRE circRNA对某些基因群具有明显的选择性。证明了不同的MRE circRNA对不同基因的转录重编程的组合控制。

图6 MRE circRNA对应激诱导转录的抑制作用在许多果蝇基因中普遍存在

7、铜胁迫下MRE circRNA与细胞内稳态的生理相关性
铜诱导细胞毒性的最重要的一种机制，由铜离子还原而成的亚铜离子能催化羟基自由基的生成，可进一步导致氧化损伤和DNA链断裂。RNA-seq显示一系列抗氧化防御和DNA损伤修复相关基因在细胞对铜胁迫的防御中显着上调(图7A)。在铜应激细胞的细胞核中显示出明显的DNA损伤信号(图7B、C)。与常规的S2细胞对照相比，所有检测到的抗氧化防御和DNA损伤修复相关基因在两种MRE circRNA稳定细胞系中都被显著抑制(图7A)；MRE circRNAs的过表达显著加重了铜诱导的DNA损伤(图7B, C)。MRE circRNAs的过表达显著降低了细胞的铜抗性(图7D)。综上所述，这些发现证实了MRE circRNA在铜胁迫下促进受损细胞清除的生理相关性。

图7 MRE circRNA加重了铜诱导的DNA损伤

三、研究结论
在重金属胁迫下，与gawky蛋白相互作用的MRE circRNA可拮抗gawky在活性染色质区域的结合，并诱导其异常的细胞质积累来抑制gawky的功能活性，特异性地调节应激诱导的转录。circRNAs中的MRE基序被确定为维持circRNA-gawky相互作用的必要RNA调控因子。circRNA-RBP染色质轴可能是真核细胞中基因表达的基本调控网络。

参考文献：
A circular RNA-gawky-chromatin regulatory axis modulates stress-induced transcription. [J]Nucleic Acids Research, 2024.