2023年发表于《Nature Communications》（IF=14.7）

一、研究背景
胰腺导管腺癌(PDAC)由于缺乏有效的早期诊断和治疗方法，预后效果不理想，迫切需要开发出更好的标志物和治疗靶点。分子分型已被用于指导许多癌症类型的临床治疗，如乳腺癌和结肠癌，但在PDAC还不能有效分型。N6-腺苷甲基化(m6A)是最普遍的RNA修饰之一，RNA m6A的异常修饰和人类癌症发生和进展的高度相关。m6A修饰有希望作为PDAC亚型的分子标记。

二、研究结果
1、PDAC转录组范围内的m6A定位
对来自65个个体的98个胰腺样本（33对PDAC和相应的正常组织以及另外32个PDAC样本）进行m6A-seq。鉴定出的m6A位点富集于经典GGACH基序(图1b)和起始密码子和终止密码子附近的区域(图1c)。

图1 PDAC中m6A修饰的全转录组定位

2、通过不同的m6 A修饰来区分两个PDAC亚型
将32个未配对的PDACs与33个正常胰腺组织的独立数据集进行比较，PDACs验证了大多数差异甲基化的m6A位点(265/288)(图1d)，并对m6A异常位点经MeRIP-qPCR和RADAR软件识别验证了可信度。288个失调的m6A位点富含与癌症通路相关的基因，如细胞周期和上皮间质转化(图1f)。癌基因如CENPF31、32、WNT7B33-35和NTSR1在肿瘤中与癌旁组织相比m6A甲基化平升高(图1g, h)。
根据这些不同的m6A峰对PDAC患者进行无监督的共识聚类，表征了两种PDAC亚型(S1和S2，图2a)。S2 PDAC显示与S1 PDAC不同的m6A模式(图2b)，但在两种PDAC亚型的癌旁组织中没有差异，表明亚型模式是肿瘤特异性的。这两种亚型与已知临床因素如性别、年龄、吸烟状况、饮酒状况、肿瘤分期、分化、血管侵犯和淋巴结转移，无相关性。m6A亚型独立于之前报道过的转录亚型。

图2 通过全转录组范围的m6A修饰进行PDAC分型

3、CSTF2驱动PDAC m6A亚型的形成
为研究PDAC亚型形成的机制。用随机森林分析和spearman相关分析来研究S2 PDAC中高甲基化的m6A与RNA结合蛋白(rbp)的相关性，发现裂解刺激因子2(CSTF2)RNA水平与S2 PDAC中m6A位点的高甲基化水平最为显著相关(图3a)。当在PANC-1和SW 1990细胞中敲除CSTF 2时，分别有86%和88%差异性m6A位点甲基化水平显著降低（图3c，d）。当CSTF 2在相同的细胞系中异位过表达时，有8804和8554个m6A位点的被高度甲基化（图3e，f）；在CSTF 2敲低的两种被检测的细胞类型中，低甲基化m6A的重叠率为72.8%和61.7%（图3g）。这些结果表明CSTF 2可能调节PDAC中mRNA的m6A水平的累积。

图3 CSTF2是促进S2 PDAC亚型中mRNA m6A累积的关键蛋白

4、CSTF2促进PDAC细胞恶性表型的形成
进一步研究CSTF 2对PDAC细胞恶性表型的影响。体外实验表明，CSTF 2的敲低显著抑制了PDAC细胞的细胞增殖、集落形成、细胞周期、迁移和侵袭能力（图4a-d）。通过小鼠皮下异种移植模型，发现CSTF 2过表达显著增强但沉默显著抑制PDAC肿瘤的生长速率（图4e）。此外，CSTF 2的强制表达促进PDAC细胞的肺转移，而CSTF 2敲低显示出相反的效果（图4f）。此外，CSTF 2敲低诱导的恶性表型抑制可以通过强制表达的CSTF 2来挽救，这意味着CSTF 2敲低的靶向效应。表明CSTF 2可能通过调节特异性基因m6A发挥作用。

图4 敲除CSTF2可抑制PDAC细胞的增殖和转移

5、CSTF2通过减缓延伸介导m6A累积
m6A writers或erasers的表达和亚细胞定位均不受CSTF 2敲低的影响，表明CSTF 2敲低后观察到的表型不太可能通过writers或erasers介导。CLIP-seq数据显示，CSTF2 RNA结合位点与RNA中的m6A位点重叠（图5a）。对CSTF2和RNA Pol II进行了CUT&Tag测序，结果显示CSTF2和RNA Pol II的基因组结合位置有很好的重叠（图5c）。DNA中的CSTF2结合位点与RNA中的CSTF2结合位点和m6A位点共定位，并且共定位与RNA Pol II相关（图5f，g）。这些结果暗示RNA Pol II可能确实在介导由CSTF2调节的m6A沉积中起作用。GRO-seq和敲低CSTF2实验证实了CSTF2降低了Pol II的延伸率。CSTF2敲低与METTL3敲低导致的m6A水平下降相当，并且METTL3敲低的细胞中低甲基化的m6A与CSTF2产生的69%(2676的1850)的m6A重叠(图5n)。CSTF2通过减缓Pol II的伸长来促进m6A沉积，从而促进了METTL3的共转录募集。

图5 CSTF2通过延缓延伸率来介导m6A的沉积

6、CSTF2调控的m6A增强了RNA的稳定性
与正常组织相比，PDAC组织中CSTF2靶基因的RNA水平更高；在PDAC细胞中也观察到m6A水平与RNA水平之间的正相关。据报道，IGF2BP家族是一个m6A reader可稳定转录。接下来研究了IGF2BP2在cstf2调节的m6As中的作用。我们发现IGF2BP2的表达不受CSTF2敲除的影响，但CSTF2敲低抑制了IGF2BP2与目标转录物的m6A区域的结合，而不改变YTHDF1/2/3在这些RNA上的结合富集。基于dCas13m6A编辑和gRNA特异性操纵m6A位点(图6c)，证实了m6A水平的下调(图6d)，抑制了IGF2BP2的结合(图6e)，导致mRNA水平(图6f)和转录本半衰期(图6g)的下调，特别是过表达IGF2BP2无法挽救m6A水平下调对mRNA水平和转录本半衰期的影响(图6h、l)。综上所述，CSTF2调控的m6As通过IGF2BP2增强了RNA的稳定性。

图6 异常的m6A增强了mRNA的稳定性

图7 CSTF2在RNA m6A沉积和PDAC亚型形成中的作用模型

三、研究结论
根据m6A的修饰特征可将PDAC分为两种不同的亚型，CSTF2通过减缓RNA Pol II的延伸率来促进METTL3的募集，并通过IGF2BP2增强了RNA的稳定性，从而促进m6A的沉积。

参考文献：
CSTF2 mediated mRNA N6-methyladenosine modification drives pancreatic ductal adenocarcinoma m6A subtypes.[J]Nature Communications, 2023.