2023年发表于《Nature Communications》（IF =16.6）

一、研究背景
肾细胞癌(RCCs)是最常见的肾肿瘤类型，可分为多个组织学亚型：透明细胞RCC (ccRCC)约占75%，乳头状RCC (pRCC)和嫌色RCC (chRCC)分别占约15%和5%。ccRCC、pRCC和chRCC的基因组和转录组学研究，揭示了RCC不同亚型之间显著的异质性，每种亚型都表现出不同的体细胞突变、染色体拷贝数改变和基因表达谱。组蛋白修饰和染色质可及性与不同RCC组织亚型的关系，以及与肾癌遗传性的关系，尚未有系统研究。
增强子是顺式作用的DNA区域，翻译后组蛋白修饰(如H3K27ac和H3K4me2)的ChIP-seq已经在哺乳动物基因组中鉴定出数百万个增强子。分析增强子已成为表征驱动细胞转录状态的关键转录因子（TF）和更好地理解种系风险变异的有力工具。细胞的身份和功能主要由主转录组因子决定，主转录因子（MTF）与增强子结合并调节建立细胞身份和功能所需的基因。此外，基于人群的表观基因组分析发现，表达量性状位点（eQTLs）的单核苷酸多态性（SNPs）通常也与附近表观基因组特征（如以H3K27ac标记的活性增强子）的变异相关联。许多先前的RCC表观遗传学数据是基于细胞系的，这些细胞系与原始肿瘤不同，并不代表所有的组织学亚型。
本研究中综合分析了H3K27ac、H3K4me2的修饰数据（ChIP-seq）、染色质可及性分析（ATAC-seq）、DNA-seq和RNA-seq的数据，定义了42例原发性人类RCC肿瘤中不同组织学亚型的RCC的表观遗传图谱和调控网络；分析了不同组织亚型中的特异增强子，亚型特异型的主转录因子（MTF）。

二、研究结果
1、绘制肾细胞癌的染色质调控网络
以研究它们的染色质状态、转录因子结合模式以及基因表达情况，42个(24个ccRCC，6个pRCC，12个chRCC)新鲜冷冻的不同RCC亚型的肿瘤样本进行了ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq测序分析。其中将患者分为2组（1和2），H3K4me2 ChIP-seq来绘制活性和静止增强子图谱，使用H3K27ac ChIP-seq来绘制活性启动子和增强子图谱。队列1(12 chRCC，6 pRCC，12 ccRCC)所有样本中共鉴定出153，321个启动子-远端(增强子)H3K27ac ChIP-Seq峰，其中大多数(n=136,469)在两种及以上以上组织亚型中共有(图1A，B)。例如，PAX8位点在所有样本中都被H3K27ac标记。PAX8是参与RCC早期肾脏胚胎发生和肿瘤发生的TF，可作为区分RCC与其他恶性肿瘤的临床诊断工具(图1C)。H3K27ac峰的分层聚类(图1D)和PCA分析清楚地区分了RCC的三种组织学亚型，chRCC的H3K27ac图谱与pRCC或ccRCC有明显差异。总共有12908个位点上调：8939个位点是chRCC特异性的，3653个位点是pRCC特异性的，316个位点是ccRCC特异性的(图1E)。这些组织特异性的H3K27ac峰被H3K4me2 ChIP-seq差异标记，并且与开放染色质相关，表明它们是组织特异性的活性增强子。此外，差异表观遗传位点与最近基因表达差异相关(图1F-H)。

图1 不同组织亚型RCC的H3K27ac图谱

对8939个chRCC特异性H3K27ac峰对应基因的GREAT分析显示，在肌动蛋白调节、脂肪酸氧化和离子跨膜转运蛋白活性中富集(图2A)，与先前报道的chRCC中离子跨膜转运特征增加的mRNA特征分析一致。对3653个pRCC特异性位点对应基因富集于肾脏系统发育有关(图2B)。由于与chRCC和pRCC相比，ccRCC的特异性位点相对较少(n=316)，并且ccRCC的增强子景观与pRCC更相似，因此我们仅比较了ccRCC和pRCC之间的H3K27ac位点。1265个ccRCC特异性峰与参与循环系统发育和血管生成的基因相关(图2C)；而2661个pRCC特异性峰与参与肾脏胚胎发生的基因相关。所有样本的H3K27ac和H3K4me2 ChIP-seq信号呈强相关(图2D)。
对每个亚型中富集的H3K27ac峰进行motif分析，发现了四个在chRCC中高度富集的motif，其中一个类似于叉头（forkhead）基序，另一个类似于与TFCP2相关的基序(图2E)。FOXI1是forkhead TF家族的成员，TFCP2L1与TFCP2密切相关，它们都与肾的插层细胞发育有关，插层细胞是chRCC的起源细胞。在chRCC中H3K27ac信号在FOXI1和TFCP2L1基因位点显著富集，而在ccRCC和pRCC中无信号或信号明显较低(图2F，G)。对ccRCC特异性增强子的motif富集分析发现，一个基序类似于基本亮氨酸拉链(bZIP)BATF基序，另一个基序类似于基本螺旋-环-螺旋(bHLH)TF家族成员HIF2α(也称EPAS1)(图2H)。具有BATF的bZIP家族中的ETS1与von-Hippel Lindau(VHL)依赖性ccRCC的肿瘤发生有关，并且在ccRCC中被H3K27ac高度富集，在pRCC中较少，而在chRCC中则没有(图2I)。众所周知，EPAS1在ccRCC中由于VHL蛋白功能的丧失而失调。它是ccRCC的主要驱动因素，是多个关键致癌途径的上游。最近的临床试验显示HIF2抑制剂在晚期ccRCC患者中具有临床效用。得分最高的pRCC特异性motif对应于HNF1β(图2J，K)。HNF1β是含有同源结构域的TF超家族的成员，参与肾脏发生，并且在pRCC中被H3K27ac高度富集(图2K)。

图2 调控元件的表观遗传学注释识别了组织学特异性通路和TFs的富集

2、特定的主转录因子（MTF）定义了RCC的亚型
接下来系统研究三种RCC组织学亚型潜在的特异性MTF。MTF通常结合在SEs中，由SEs调控，并在转录核心调控回路(CRC)中相互调控。本研究利用RNA-seq、ChIP-seq和ATAC-seq数据来鉴定潜在的组织学特异性MTF(图3A)。结合了(1)不同RCC组织学亚型差异表达TF的表达数据；(2)相对于其他癌症类型，RCC组织学亚型特异性TF(CaCTS)；(3)不同RCC组织学亚型间差异SE相关TF；(4)在调控网络中具有组织学特异性的TF。这四项分析确定了200多个候选TF，对下游验证进行了优先排序选择了50个候选组织学特异性MTF(N=20，chRCC；N=14，pRCC；N=16，ccRCC)，包括FOXI1、TFCP2L1和DMRT2（chRCC）；EPAS1、ETS1、BARX2、ZNF395（ccRCC），HNF1B和NR2F2（pRCC）(图3B)。TCGA KICH、KIRC和KIRP队列的基因表达数据集验证了正常组织中没有该TF特异性。为了在蛋白质水平上验证概念，通过免疫组织化学(IHC)研究了MTF的表达特异性和定位。选择了四个具有代表性的MTF(BHLHE41、HNF1β、NKX6.1和ZNF395)，发现不同组织学亚型的蛋白表达水平有显著变化(图3C)。更具体地说，两个ccRCC特异性MTF(BHLHE41和ZNF395)在ccRCC肿瘤中高度表达。接下来，通过检查ccRCC和chRCC中的EPAS1细胞，确认了MTF EPAS1在体内的组织学特异性结合(图3D)。亚型特异性EPAS1结合位点高度富集于H3K27ac亚型特异性位点。ccRCC特异性EPAS1结合位点富集于免疫细胞和白细胞活化途径，而chRCC特异性EPAS1结合位点富集于代谢过程和脂肪酸活化途径(图3E，F)。
为了进一步验证本研究的方法，即特定的MTF驱动不同RCC组织学的转录特性，在ccRCC细胞系中操纵TF表达。假设过表达ccRCC特异性TF和抑制ccRCC特异性TF可以改变ccRCC细胞系786-O的转录图谱，使其变得更像chRCC。在MTF分析中，FOXI1评分为chRCC特异性TF(图3B)，EPAS1对ccRCC具有高度特异性(图3B)，并且先前的研究已经说明了它在ccRCC51发病机制中的作用。对786-O中FOXI1 OE/EPAS1 KD下调基因的基因集富集分析(GSEA)显示，与免疫应答相关的基因富集(图4A)。在786-O细胞中，伴随的FOXI1 OE和EPAS1 KD导致chRCC特异性主转录因子（MTF）如TFCP2L1和NR3C2的上调，以及ccRCC特异性主转录因子（MTF）如ETS1和ZNF395的下调(图4B)。进一步的监督分析表明，与EPAS1 KO/FOXI1 OE细胞株相比，EPAS1的下游靶点CAIX在WT 786-O细胞株中显著过表达。相比之下，与WT 786-O细胞系相比，CD117在EPAS1 KO/FOXI1 OE细胞系中过表达(图4C)。
然后，比较了实验条件下786-O和本研究RCC肿瘤表达数据之间的差异表达基因(图4D)。将chRCC和ccRCC基因集定义为每种组织学中相对于其他组织的前100个上调基因，我们发现与对照相比，786-O FOXI1 OE/EPAS1 KD细胞系中chRCC基因集在上调基因中富集(图4E)，而786-O对照与FOXI1 OE/EPAS1 KD细胞系中ccRCC基因集在上调基因中富集(图4F)。FOXI1 OE/EPAS1 KD 786-O细胞系显示，chRCC特异性候选MTF：TFCP2L1、GATA2、DDIT3、NKX6-1的表达显著升高，ccRCC特异性候选MTF：ZNF395和TSC22D3的表达显著降低。总之，这些数据表明，在ccRCC细胞系786-O中，无论是否敲低EPAS1，单一chRCC候选主转录因子（MTF）FOXI1的过表达都会导致显著的表达变化，从而使该细胞系更像chRCC细胞系。

图3 多维整合分析识别了组织学特异性的主转录因子（MTF）

图4 在一个ccRCC细胞系中，两个主转录因子（MTF）的表达变化会导致细胞系更类似于chRCC的转录谱

3、等位基因失衡反应了遗传性肾细胞癌的风险变异

等位基因失衡，即ChIP-seq reads中杂合子差异等位基因的单核苷酸多态性(SNPs)，提供了两种单倍型之间顺式调控活性的体内比较(图5A)。因此，等位基因失衡可以突出通过GWAS候选因果变异与RCC风险相关的位点上的功能相关性。分析许多个体表观基因组的一个关键优势是能够捕获杂合位点，并通过分析等位基因失衡来测量TF结合对调控元件的影响。为此，本研究评估了来自这些RCC样本的ChIP-seq数据中的染色质等位基因失衡，以便从RCC的GWAS中发现因果风险SNPs。将stratAS32应用于20个ccRCC和6个pRCC的H3K27ac ChIP-seq数据，在ccRCC和pRCC183099个峰中，确定了10605个染色质不平衡的H3K27ac峰，将其定义为多个假设检验校正后具有一个或多个不平衡SNPs的峰(图5B)。

假设染色质AI峰与主转录因子（MTF）结合的调控元件相对应。在这些元件中，反式作用因子(即MTF)的存在可能导致调控元件活性，可观察到H3K27ac AI峰值。例如rs4903064(chr14:73279420;14q24.2)，DPF3的eQTL(图5C)。rs4903064在我们的H3K27Ac数据集中是等位基因不平衡的，已被证明在所有三种组织学亚型(ccRCC,chRCC和pRCC)中都是GWAS的风险变异，并且该SNP的改变的C等位基因被认为可以创建HIF结合基序(图5D)。

为了证实这一点，用23例ccRCC患者的43个样本中使用转录因子EPAS1的ChIP-seq数据来研究GWAS风险变异rs4903064对EPAS1结合的影响。对11个原发、21个转移性ccRCC样本和11个正常肾组织样本的分析表明，在肿瘤和正常组织中，纯合子C/C等位基因的肿瘤都显著富集了EPAS1峰(图5E，F)，rs4903064是EPAS1 cQTL。这证实了先前的文献，即c等位基因产生HIF结合位点。

应用染色质AI分析来注释由GWAS识别的RCC58的风险SNPs。LD评分回归分析显示，RCC GWAS风险变异的染色质AI峰高度富集。将不平衡的H3K27ac峰细分到TFs可能结合的可接近染色质区域发现了大量的额外富集（图5G，H）。相比之下，来自UK Biobank的多种其他GWAS表型与RCC GWAS SNPs相比，富集程度要低得多，这表明这种富集对RCC具有特异性(图5H)。

使用这种方法，能够精细绘制总共30个风险SNPs，例如位于chr 12上的Rs7132434被认为是一种改变AP-1结合导致BHLHE41上调的功能性变异，从而通过诱导IL-1163促进肿瘤生长(图5I)。另一个例子是rs4733579(图5I)。后者已被证明通过调节MYC和PVT1的表达来促进RCC的易感性。rs46552601和rs46541176(图5J)，它们都位于EPAS1基因的chr2p21上，这两个SNPs仅在ccRCC中存在H3K27Ac的等位不平衡，而在pRCC中没有，这与EPAS1(HIF2-α)在ccRCC发病机制中的特定作用一致(图5K)。可进一步从功能上验证这两个SNPs在ccRCC发病机制中的作用。

图5 在ccRCC和pRCC中存在等位基因不平衡的H3K27ac峰

三、研究结论

通过对ccRCC、pRCC、chRCC的ChIP-seq、ATAC-Seq、RNA-seq和SNPs数据的分析，发现了50个主转录因子(MTF)可用于RCC组织学亚型分型，通过免疫组织化学方法确认了组织特异性MTFs，并通过786-O ccRCC细胞系实验验证了FOXI1是chRCC的MTF。将RCC GWAS风险SNPs与H3K27ac ChIP-seq和ATAC-seq数据相结合，发现等位基因失衡可反应遗传性肾细胞癌的风险变异。

参考文献:

Epigenomic charting and functional annotation of risk loci in renal cell carcinoma.[J]Nature Communications, 2023.