2023年发表于《Cell Reports》（IF =8.8）

一、研究背景
RNA在转录后会进行各种修饰，其中N6甲基腺苷(m6A)修饰在哺乳动物mRNA中普遍存在。甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)能够检测整个转录组中全面的m6A修饰位点。已有研究表明m6A公认的功能是调节mRNA稳定性，参与pre-mRNA加工和翻译，影响多种生理机制，包括细胞增殖、免疫稳态、干细胞分化、有丝分裂和性别决定。此外，异常的m6A修饰还参与包括癌症在内的多种疾病的发生和进展。
m6A修饰的水平由几种“writer”甲基转移酶和“eraser”去甲基化酶质动态调节，并通过“reader”结合蛋白发挥其作用。典型的writer复合体包含类甲基转移酶3(METTL3)和METTL14，其中METTL3是关键的RNA甲基转移酶。METTL14介导的靶标识别的机制及其生物学作用仍然很大程度上未知。一项泛癌分析在METTL14的高度保守的氨基酸残基R298处发现了一个突变热点。METTL14 R298P突变主要在子宫内膜癌患者中发现，而R298C和R298H突变在多种实体瘤中观察到（图1A），这表明R298在METTL14的功能中发挥着关键作用。之前的一项研究报告称，METTL14 R298P突变体的过度表达不会引起子宫内膜癌细胞中的基序改变。因此，METTL14 R298P突变被认为是功能失调的突变。
在本研究中，通过在HEC108子宫内膜癌细胞中插入杂合或纯合R298P突变来研究METTL14 R298P突变是否仅仅是功能丧失突变。这种干预并不影响细胞中METTL14或METTL3的表达。结果发现，虽然含有突变型METTL14 (R298P)的writer复合物降低了甲基化活性，但其在异常基序上修饰了m6A，这在含有纯合R298P突变的细胞中很明显。异常修饰改变了周围典型基序的甲基化效率，改变了某些mRNA的稳定性，进而影响了细胞增殖率。

二、研究结果
1、杂合子和纯合子METTL14 R298P突变对癌细胞增殖产生相反的影响
为了研究癌症相关的METTL14 R298P突变如何影响m6A甲基化模式及其生物学影响，首先使用CRISPR-Cas9建立了携带METTL14 R298P突变的子宫内膜癌细胞系(HEC108)，并获得了多个携带METTL14 R298P突变的克隆。杂合条件(METTL14+/Mu)或纯合条件(METTL14Mu/Mu)中的METTL14 R298P突变以及插入以增加同源重组的沉默突变(SM)（图1B和1C）。观察到METTL14 R298P突变不影响METTL14或METTL3的蛋白表达（图1D）。此外，根据公共数据库表明HEC108细胞中的METTL14拷贝数为2，我们观察到我们建立的METTL14突变的HEC108细胞系也含有两个METTL14基因拷贝（图1E和1F）。


图1 通过基因组编辑建立携带METTL14 R298P突变的子宫内膜癌细胞系

接下里评估了METTL14 R298P突变如何影响体外和体内细胞增殖。与野生型（METTL14+/+）细胞相比，携带METTL14+/Mu突变的HEC108细胞在体外表现出增强的细胞增殖率（图2A）。相反，METTL14Mu/Mu突变显着降低了细胞增殖率。在仅含有SM的METTL14转基因的HEC108细胞中表达METTL14蛋白来检查SM的效果。分析表明，SM不影响蛋白质表达或细胞活力，细胞增殖率的差异是由杂合和纯合R298P突变引起的，与SM不相关。为了在体内评估这种差异，将HEC108细胞皮下注射到裸鼠体内建立异种移植小鼠模型。观察到METTL14+/Mu细胞形成的肿瘤明显比METTL14+/+细胞大，而携带METTL14Mu/Mu突变的细胞形成的肿瘤明显更小（图2B）。此外，当腹腔注射到小鼠体内时，METTL14+/Mu细胞明显形成更多的腹膜肿瘤，METTL14Mu/Mu细胞形成的肿瘤明显较少（图2C）。
通过ICGC分析了RNA-seq结果，没有观察到METTL14基因的拷贝数改变。相比之下，在大多数情况下，METTL14 R298P和R298H突变的等位基因频率均低于50%，这意味着该突变在大多数癌症样本中是杂合的（图2D）。综上结果表明，在癌症样本中METTL14 R298P杂合突变可促进致瘤性，纯合突变对癌症进展发挥抑制作用。

图2 杂合子和纯合子的METTL14 R298P突变对癌细胞增殖的相反影响

2、METTL14 R298P突变减少m6A修饰
为了阐明METTL14+/Mu和METTL14Mu/Mu突变对癌细胞增殖产生相反影响的分子机制，本研究比较了每种基因型中m6A修饰水平。质谱分析表明，METTL14+/Mu细胞中m6A修饰水平显着降低，并且METTL14Mu/Mu细胞中水平进一步降低（图3）。进一步证实SM不影响m6A修饰。这些结果表明METTL14 R298P突变降低m6A修饰的总水平与突变蛋白剂量相关；然而，酶活性或靶标识别的简单丧失不太可能是METTL14+/Mu和METTL14Mu/Mu细胞之间细胞增殖率差异的唯一原因。

图3 METTL14 R298P突变减少了子宫内膜癌细胞系中m6A的修饰

3、突变体METTL14 (R298P)识别m6A修饰的异常基序
鉴于METTL14在目标识别中发挥作用，接下来研究R298P突变是否影响m6A修饰模式。 进行了MeRIP-seq分析，通过使用抗m6A抗体进行RNA免疫沉淀，表明大多数目标基因在很大程度上是在METTL14+/+、METTL14+/Mu和METTL14Mu/Mu细胞之间共享（图4A）。所有三种基因型的MeRIP-seq峰在终止密码子周围高度富集（图4B）；这种分布模式与之前的MeRIP-seq研究类似，并且R298P突变可能会改变METTL14的靶标识别。
使用exomePeak和MetDiff分析重点关注每个基因型之间差异甲基化的MeRIP-seq峰，进一步分析了突变的METTL14识别基序。exomePeak分析表明，与METTL14Mu/Mu细胞相比，METTL14+/+和METTL14+/Mu细胞中包含的典型基序在甲基化程度更高的峰中显着富集。相反，与METTL14+/+细胞相比，异常5’-AC-3’基序在METTL14Mu/Mu细胞中甲基化程度更高的296个峰中富集。在这296个峰中，m6A-Atlas数据库中注释了512个典型m6A修饰位点。在这些位点中，无论METTL14基因型如何，MeRIP-seq测序的平均深度显著高于所有腺苷，这表明这些典型位点仍可被突变体METTL14（R298P）甲基化（图4D）。相比之下，在METTL14+/Mu样品中，GGAUU和GAAUU基序中腺苷的免疫沉淀测序读数的平均深度显着富集，而在METTL14+/+样品中未观察到这一点。这种富集在METTL14Mu/Mu样品中得到进一步增强（图4D）。此外，MetDiff分析检测到的差异甲基化峰多于exomePeak检测到的峰，表明在METTL14Mu/Mu细胞中甲基化程度较低的峰中再次检测到了包含典型5’-AC-3’的基序，而异常5’-AU-3’基序在METTL14Mu/Mu细胞中甲基化程度更高的峰中富集。综上所述，这些数据表明，尽管METTL14 (R298P)可以在一定程度上识别规范基序，但该突变蛋白也会甲基化异常5’-AU-3’基序中的腺苷。

图4 纯合子METTL14 R298P突变诱导的靶标的异常识别

4、尽管m6A修饰减少，但METTL14Mu/Mu细胞中c-Myc mRNA的表达减少
为了识别m6A修饰控制下并参与细胞增殖分子途径的基因，使用基因集富集分析(GSEA)比较了不同METTL14基因型之间的基因表达。该分析表明，与METTL14+/+细胞相比，METTL14+/Mu细胞中原癌基因c-Myc靶向的基因表达水平显着增加（图5A）。c-Myc抑制剂以剂量依赖性方式降低HEC108细胞的活力，表明c-Myc有助于这些细胞的细胞增殖（图5B）。已知c-MycmRNA的表达受到m6A修饰的调控，在MeRIPseq分析中观察到多个甲基化峰，其中包括典型位点（图5C）。为了检查HEC108细胞中c-Myc mRNA的稳定性是否受到m6A修饰的调节，测量了添加放线菌素D（Act.D）抑制转录后c-Myc mRNA的降解率。该分析表明，METTL14+/Mu和METTL14Mu/Mu细胞中的降解率均显著降低（图5D），这表明由于METTL14 (R298P)突变导致的m6A修饰的减少稳定了c-Myc mRNA。
METTL14+/Mu细胞中c-Myc mRNA的表达显着增加，但METTL14Mu/Mu细胞中c-Myc mRNA的表达却下降（图5E）。因此，GSEA显示，与METTL14+/+细胞相比，c-Myc靶向基因的表达水平在METTL14Mu/Mu细胞中显着降低（图5F）。由突变体METTL14 (R298P)识别的异常基序在c-Myc mRNA中未甲基化（图5C）。总的来说，这些数据表明，减少的m6A修饰可以稳定c-Myc mRNA，这可能有利于METTL14+/Mu细胞增殖；而在METTL14Mu/Mu细胞中，c-Myc mRNA表达减少的某种机制很可能主导m6A修饰对c-Myc mRNA的影响。


图5 c-Myc mRNA通过METTL14 R298P突变来稳定

5、异常的m6A修饰使c-MET mRNA不稳定，导致c-Myc的表达减少
为研究异常识别基序上的m6A修饰对基因表达的影响，比较METTL14+/+和METTL14Mu/Mu细胞之间包含差异甲基化峰的基因的表达水平。与METTL14Mu/Mu细胞相比，METTL14+/+细胞中甲基化峰值较高的基因显著上调（6A）。进一步将METTL14Mu/Mu细胞中甲基化程度较高的基因（285个基因）分为两个亚组，一组具有典型m6A位点（174个基因），另一组不具有典型m6A位点（111个基因），并分析相应基因的表达，具有典型m6A位点的基因的表达水平显着降低（图6B）。这些数据表明，异常的m6A修饰可能会改变典型基序的甲基化效率，从而影响相应mRNA的稳定性。

图6 突变体METTL14（R298P）介导的异常m6A修饰降低了典型m6A位点的基因表达

为了找到受异常m6A修饰影响并参与c-Myc上游信号通路的基因，重点关注c-MET，它是一种受m6A修饰调节的原癌基因，已知在子宫内膜癌中发挥着关键作用。GSEA表明，c-MET靶标的表达在METTL14Mu/Mu细胞中显著下调（图7A）。因此，METTL14Mu/Mu中c-MET mRNA的表达显着降低，导致c-MET蛋白表达降低（图7B、7C）。在METTL14+/Mu细胞中未观察到这种改变。为了研究m6A修饰在异常基序中的作用，首先使用c-MET mRNA中含有异常基序(5’-GGAUU-3’)的RNA探针进行电泳迁移率变动测定(EMSA)。该分析表明，与典型基序(5’-GGAUU-3’)中的m6A相比，异常基序中的m6A较少被m6A结合蛋白YTHDF2识别。与METTL14+/+细胞相比，c-MET mRNA异常基序中的腺苷在METTL14Mu/Mu中高度甲基化。与此同时，METTL14Mu/Mu细胞中典型基序周围的腺苷也更加甲基化。
测量了添加Act.D抑制转录后c-METmRNA的降解率。该分析表明METTL14Mu/Mu细胞中的降解率显着增加（图7E）。此外，添加c-MET抑制剂福替尼降低了METTL14+/+和METTL14+/Mu细胞中的c-Myc表达和细胞活力（图7F和7G）。综上所述，靠近异常m6A修饰位点的典型基序的甲基化效率增加，最有可能导致c-MET mRNA的稳定性降低，从而导致c-Myc表达减少，并抑制METTL14Mu/Mu细胞中的细胞增殖。

图7 突变体METTL14介导的异常m6A修饰使c-MET mRNA稳定性降低

三、研究结论
METTL14杂合突变促进癌细胞增殖，METTL14纯合突变抑制癌细胞增殖。突变体METTL14诱导异常基序的m6A修饰，异常的m6A修饰会破坏c-MET mRNA的稳定性，从而减少细胞增殖。

参考文献:
A cancer-associated METTL14 mutation induces aberrant m6A modification, affecting tumor growth.[J]Cell Reports, 2023.