2023年发表于《Cell Death & Disease》（IF =9.0）

一、研究背景
胃癌作为全球第五大流行癌症，可能因肿瘤微环境的异质性和复杂性，导致晚期疾病的总生存率仍然很低，而靶向肿瘤微环境细胞是改善胃癌患者的预后的新途径。间充质干细胞（MSC）在协调肿瘤微环境和调节肿瘤细胞的许多方面（包括细胞增殖、转移、血管生成和免疫逃避）中起着至关重要的作用，不同的内外部因素，如胃癌来源的外泌体、特异性抗癌药物和失调的miRNA表达，可以将MSC重编程为肿瘤促进表型，有助于胃癌的发展和进展。在胃癌中，RNA m6 A水平升高与预后不良有关；m6 A修饰在调节干细胞的表型中起关键作用；m6 A修饰控制正常骨髓干细胞的分化并维持乳腺癌干细胞的自我更新潜力。然而，m6 A修饰在肿瘤微环境MSC中的作用仍不清楚。因此推测，改变RNA m6 A修饰可能调节MSC的表型和功能，从而促进胃癌的进展。
本研究中，发现在胃癌组织来源的间充质干细胞（GC—MSCs）的集落刺激因子2（CSF2）的升高。CSF2上调诱导MSC向促癌表型转变，从而促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。m6A阅读器蛋白IGF2BP2结合并增强CSF2 mRNA的稳定性。此外，CSF2通过诱导Notch 1泛素化负调控Notch信号通路。MSC的表型和功能是由胃癌中m6A修饰调节，并为胃癌的治疗提供了新的策略。

二、研究结果
1、在肿瘤状态的MSCs中CSF2表达水平和m6A修饰水平增加
首先检测了来自不同来源的MSCs的转录组的变化，包括GC-MSCs(胃癌组织来源的MSCs)和GCN-MSCs(非癌来源的MSCs)，正常MSCs和P-MSCs(胃癌细胞条件培养液预处理的MSCs)。与GCN-MSCs相比，GC-MSCs中共有4699个基因表达发生了变化。与正常MSCs相比，P-MSCs中有3140个基因表达发生了变化(图1A)。然后，对正常MSCs和P-MSCs进行了MeRIP-seq。
MeRIP-seq结果显示，与正常MSCs相比，P-MSCs中有318个基因的m6A水平发生了显著变化，其中35个基因的表达和m6A修饰水平都发生了变化(图1A)。对这35个基因的聚类分析确定了在GC-MSCs和P-MSCs中同时上调的9个基因(图1B)。并通过qRT-PCR和MERIP-qPCR进行了验证，发现P-MSCs和GC-MSCs中CSF2的表达分别是正常MSCs和GCN-MSCs的32倍和7倍(图1C)。此外，在P-MSCs和GC-MSCs中，CSF2的m6A修饰水平分别比正常MSCs和GCN-MSCs高约3倍(图1D)。培养上清液中CSF2蛋白水平的ELISA分析表明，P-MSCs和GC-MSCs的CSF2蛋白水平分别是正常MSCs和GCN-MSCs的2.5倍和7.5倍(图1E)。
TCGA数据库分析还显示，胃癌标本中CSF2的水平高于正常胃组织。胃癌患者的病理切片的免疫组织化学分析显示，CSF2主要在胃腺底部的粘膜组织中表达(图1F)。免疫荧光结果显示，间充质干细胞标记物α-SMA也主要定位于胃腺底部，并与CSF2在胃癌组织中共同定位。在术后1年内复发的患者中，胃癌组织中CSF2的阳性率约为46%。在手术治疗后3年内没有复发的患者中，胃癌组织中CSF2的阳性率约为9%(图1F)。综上所述，这些发现表明在肿瘤条件下MSCs中CSF2的m6A修饰和基因表达增加，胃癌组织中CSF2的高水平与预后不良有关。

图1 在MSC重编程过程中，CSF2的表达和m6 A的修饰水平增加

2、CSF2诱导间充质干细胞向促肿瘤表型转化
为了阐明CSF2在调节MSC表型和功能中的生物学作用，进行了CSF2在正常MSCs中的过表达和在P-MSCs中的下调。在CSF2高表达的MSCs中，与对照组相比，对胃癌细胞的趋向性显著增强(图2A)。在MSCs中，CSF2过表达是FAP和α-SMA的基因和蛋白水平上调(图2B，C)。相反，CSF2基因敲除抑制了P-MSCs对胃癌细胞的趋向性(图2A)；FAP和α-SMA的表达比对照P-MSCs下调(图2B-C)。在MSCs中过表达CSF2导致GM-CSF、肿瘤坏死因子-α、成纤维细胞生长因子、PDGFBB和IL-1β的产生增加(图2D)，而当CSF2在P-MSCs中被敲低时，这些因子的分泌减少(图2D)。
收集CSF2过表达的MSCs和CSF2基因敲除的P-MSCs的培养上清，用于治疗人胃癌细胞。与对照MSCs相比，CSF2过表达的MSCs上清液促进了胃癌细胞的存活率(图2E)、细胞克隆形成(图2F)和迁移(图2G)。CSF2高表达组5-FU的IC50值是对照组的1.5倍(图2H)。经5-FU处理后，CSF2高表达组MSCs的凋亡率约为对照组的一半(图2I)。相反，与P-MSC组相比，CSF2基因敲除降低了P-MSCs在促进胃癌细胞存活率(图2E)、细胞集落形成(图2F)、迁移(图2G)、降低5-FU(图2H)和凋亡率(图2H)方面的作用。GCN-MSCs和GC-MSCs的培养上清液对胃癌细胞也有类似的作用。
综上所述，表明CSF2在调节胃癌中MSCs的亲肿瘤表型和功能方面起着关键作用。

图2 CSF2 可调节间充质干细胞的促肿瘤表型和功能

3、IGF2BP2增强MCSs中CSF2 mRNA的稳定性和m6A修饰水平
在肿瘤条件下的MSCs中，IGF2BP2蛋白显著上调，IGF2BP2蛋白是m6A修饰的关键结合蛋白。与MSCs和GCN-MSCs相比，IGF2BP2在P-MSCs和GCMSCs的基因和蛋白水平上分别上调(图3A)。
为了研究IGF2BP2是否调控CSF2，设计了全长CSF2基因载体，并进行了RNA pulldown。银染显示CSF2组在70 kDa左右有一条蛋白质带(图3B)，随后的Western blot分析证实IGF2BP2与CSF2 mRNA结合(图3B)。RIP结果显示，IGF2BP2抗体组CSF2 mRNA的表达比免疫球蛋白对照组增加了约45倍(图3C)，进一步支持了IGF2BP2和CSF2mRNA之间的相互作用。此外，IGF2BP2在MSCs中的过表达导致CSF2在基因和蛋白水平上的表达增加，而IGF2BP2在P-MSCs中的敲除导致CSF2的表达降低(图3D)。值得注意的是，IGF2BP2基因敲除显著减少了P-MSCs中CSF2 mRNA的半衰期，表明IGF2BP2调节CSF2的mRNA稳定性(图3E)。 鉴于METTL3是最常见的m6A甲基转移酶之一，在MSCs中过表达了METTL3，并观察到CSF2和IGF2BP2在基因和蛋白水平上的表达增加。相反，在P-MSCs中敲除METTL3抑制了CSF2和IGF2BP2的表达(图3F)。MeRIP-seq分析表明，CSF2中的m6A峰主要位于5号染色体短臂上的132075875-132076023位置，含有AGAWAC基序(图3F)。TCGA数据分析表明，IGF2BP2在胃癌组织中的表达高于正常组织。此外，IGF2BP2和CSF2在胃癌组织中的表达呈正相关，相关系数为0.54。IGF2BP2在术后1年内复发的胃癌患者中的阳性率约为55%，而在3年内未复发的患者中的阳性率约为17%(图3G)。综上所述，这些发现表明IGF2BP2增强了CSF2的mRNA稳定性，并通过m6A依赖的方式促进其在MSCs中的表达。

图3 IGF2BP2增强MCSs中CSF2 mRNA的稳定性和m6A修饰水平

4、IGF2BP2介导的CSF2 m6A修饰是MSC重新编程的关键
进一步研究了IGF2BP2在MSC重新编程中的潜力。IGF2BP2在MSCs中的过表达导致对胃癌细胞的趋向性增加(图4A)。IGF2BP2过表达还导致FAP和α-SMA在MSCs中的表达增加(图4B，C)。值得注意的是，当同时敲低CSF2(图4A-C)时，这些效应被逆转。此外，P-MSCs中IGF2BP2基因敲除显著抑制了它们对胃癌细胞的趋向性(图4A)，并降低了P-MSCs中FAP和α-SMA的表达(图4B，C)。值得注意的是，通过与CSF2共转染，可以挽救IGF2BP2基因敲除的抑制作用(图4A-C)。
与对照组相比，IGF2BP2高表达MSCs组的培养上清液促进了胃癌细胞的增殖(图4E，F)、迁移(图4G)和耐药性(图4H，I)。然而，在IGF2BP2过表达的MSCs中，CSF2的促进肿瘤作用在消融后减弱(图4E-I)。相反，IGF2BP2在P-MSCs中的敲除导致其对胃癌细胞增殖(图4E，F)、迁移(图4G)和耐药性(图4H，I)的促进作用减弱。然而，CSF2的重新引入进一步挽救了这些效应(图4E-I)。因此，这些发现表明CSF2作为IGF2BP2的下游靶点，促进胃癌中MSCs的重新编程。


图4 IGF2BP2调节CSF2 m6 A修饰，诱导MSC重编程

5、CSF2诱导Notch1泛素化使MSCs Notch信号失活
为了阐明CSF2诱导MSC重编程的机制，进行了RNA-seq，分析了对照（载体）和CSF2转基因MSCs之间的差异表达基因。与对照组相比，CSF2过表达导致80个基因上调和62个基因下调(图5A)。鉴定了前30个差异表达基因，包括KISS1、LYZ和SLC6A13(图5B)。KEGG分析表明这前30个基因参与了与癌症相关的多个信号通路(图5C)。利用WikiPathways数据库进行的基因浓缩分析和弦图可视化显示，Notch1信号在改变的途径中排在第一位，P值最低(图5D)。此外，在CSF2转基因的MSCs中，Notch信号通路的基因表达下调，并且该通路的浓缩分数显著高于其他信号通路(图5E)。
为了验证测序结果，用qRT-PCR检测了Notch通路的受体和配体亚型以及目的基因HES1的表达。CSF2在MSCs中的过表达导致Notch1和HES1的表达降低，而CSF2在P-MSCs中的表达下调则使其表达增加；Notch信号通路的其他配体或受体的表达没有显著差异。Western blot分析表明，CSF2下调了MSCs中Notch1的蛋白水平，而CSF2基因敲除上调了Notch1蛋白的水平(图5F)。 pulldown实验和质谱分析没有发现CSF2 RNA和Notch1蛋白之间存在任何物理相互作用。提示CSF2可能通过调节Notch1的蛋白水平来影响Notch1的功能。
CSF2过表达显著降低NOTCH1的表达，这一作用可被特异性蛋白酶体抑制剂MG132抑制(图5G)。此外，放线菌酮(CHX)检测结果表明，在CSF2基因敲除的P-MSCs中，Notch1蛋白的半衰期比对照细胞长，这表明CSF2在翻译后水平调节Notch1蛋白(图5H)。Co-IP实验检测共转染CSF2/siRNAs和泛素(Ub)的MSCs中泛素化Notch1的表达水平。结果表明，CSF2过表达显著增加内源性泛素化Notch1的水平，而CSF2基因敲除则相反(图5I)。因此，这些发现表明CSF2诱导MSCs中Notch1泛素化。

图5 CSF2诱导骨髓间充质干细胞中Notch1泛素化

6、IGF2BP2/CSF2/Notch1轴调节胃癌MSC重编程
进一步阐明IGF2BP2/CSF2/Notch1轴在调节MSCs在胃癌中的表型和功能中的作用。Notch1共转染部分逆转了CSF2对MSC表型和功能的影响，包括对胃癌细胞的趋向性(图6A)，FAP和PDGFMA的表达增强(图6B，C)，以及GM-CSF和PDGFBB的分泌(图6D)。此外，共转染Notch1抑制了CSF2高表达MSCs培养上清对胃癌细胞增殖(图6E，F)、迁移(图6G)和耐药性(图6H)的刺激作用。相反，将Notch1抑制剂与CSF2基因敲除在P-MSCs中共转染显示挽救了脑脊液抑制剂的抑制作用，包括增强对胃癌细胞的趋向性(图6A)，增强FAP和α-SMA的表达(图6B，C)，增加炎症因子GM-CSF，成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子-BB的表达(图6D)。带有CSF2基因敲除的P-MSCs的培养上清对胃癌细胞的增殖(图6E，F)、迁移(图6G)和耐药性(图6H)的抑制也被Notch1共同抑制增强。同样，共转染Notch1可逆转IGF2BP2对MSCs的作用。综上所述，这些结果提示IGF2BP2/CSF2/Notch1轴在调节MSCs在胃癌中的重编程中起着重要作用。

图6 IGF2BP2/CSF2/Notch1轴调控间充质干细胞重编程

7、IGF2BP2/CSF2/Notch1轴重编程间充质干细胞促进体内胃癌进展
为了进一步研究 CSF2 介导的MSCs重编程在促进胃癌体内进展中的作用，用 HGC-27 细胞和不同来源的MSCs（1:1 比例）构建了皮下异种移植小鼠肿瘤模型。
CSF2高表达MSC组和P-MSC组的肿瘤体积明显大于对照组MSC组，而CSF2和IGF2BP2基因敲除组的肿瘤体积明显小于P-MSC组(图7A)。肿瘤生长曲线结果显示，CSF2过表达的MSC和P-MSC组的肿瘤生长速度明显快于对照组，而P-MSCs中CSF2基因敲除和IGF2BP2基因敲除显著降低了肿瘤生长速度(图7B)。 免疫组织化学结果显示，CSF2高表达MSC组和P-MSC组Ki-67表达增加，Notch1表达降低。与对照组相比，CSF2基因敲除组和IGF2BP2基因敲除组P-MSC中Notch1的表达增加。此外，P-MSC组IGF2BP2的表达高于MSC组(图7D)。为了进一步验证，使用癌症来源的MSCs，并评估了GC-MSCs中CSF2和IGF2BP2基因敲除对肿瘤生长的影响得到类似的结果。总之，这些发现表明IGF2BP2/CSF2/Notch1轴重新编程MSCs以促进胃癌进展。

图7 IGF2BP2/CSF2/Notch1轴重编程MSC，促进体内胃癌进展

三、研究结论
胃癌MSCs重编程有IGF2BP2/CSF2/Notch1轴调节，其中IGF2BP2增强MCSs中CSF2 mRNA的稳定性和m6A修饰水平，CSF2诱导Notch1泛素化从而调节MSC重新编程，促进促进体内胃癌进展。

四、参考文献
IGF2BP2-meidated m⁶A modification of CSF2 reprograms MSC to promote gastric cancer progression.[J]Cell Death & Disease, 2023.