2023年发表于《Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease》（IF =6.2）

一、研究背景
骨骼作为一个重要的器官，其骨基质稳态是由多种细胞调节的，包括骨细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等。间充质干细胞(MSCs)被认为是一种成体干细胞，具有自我更新能力、多方面的细胞分化和免疫调节功能。因此，有必要探索有效的方法来刺激MSCs的成骨分化，以提高组织工程骨相关骨修复材料的效率和效果。TF在调节成骨细胞分化和矿化过程中起着密切的相互作用。Sox2、E2F1、FZD1、Runx2、Dlx5、OSX/SP7、ATF4等转录因子参与介导成骨细胞分化和矿化。间充质干细胞成骨过程中与TF相关的染色质可及性动态图谱的研究很少。ATAC-Seq发现开放的染色质区域，预测调节TF，定位核小体位置等。在活跃的常染色质状态下，TF可以结合开放的染色质区域和DNA调控元件来调节基因表达。ATAC-seq可以识别特定生物过程中全基因组转录调控元件和转录活性基因组区域，促进了对基因表达调控过程的研究。

本研究采用碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红S (ARS)染色对成骨细胞分化和矿化进行了验证。随后进行了RNA-seq，在mRNA水平上揭示了MSCs成骨四个阶段的不同基因表达。并利用ATAC-seq建立全基因组染色质可及性动态图谱。最后，对RNA-seq和ATAC-seq进行了综合分析，确定了与成骨细胞形成相关的重要信号通路、TF和靶基因。这些发现可能为成骨细胞分化和矿化过程中染色质可及性的潜在分子调控机制提供新的研究基础。

二、研究结果
1、染色质可及性和转录图谱的综合分析

为探索成骨细胞分化和矿化的潜在机制，本研究从小鼠骨髓中获得间充质干细胞(MSCs)，并进行体外培养，分析了成骨过程中四个关键时间点的转录组和染色质可及性，包括0、7、14和21天之后的成骨细胞分化(增殖：第1期，0-7天，基质成熟：第2期，7-14天，矿化：第3期，14-21天)(图1A)。ALP染色和ARS染色结果证明，在成骨剂的诱导下，骨髓来源的MSCs在21天后完全分化为成熟的成骨细胞(图1B)。

ATAC-seq数据质控显示每个重复平均获得200 bp，这证明每个文库中的reads主要位于开放的染色质区域，可以进行后续分析(图1C)。转录起始位点（TSS）处的密度最高，这表明reads的分布与高等真核生物的典型特征一致(图1D)。比较0天和7天组的差异时，分别发现了6362个开启峰和9853个关闭峰；染色质可及性峰的数量从0天到21天逐渐减少(图1E)。以上结果表明，第0天至第7天可能是成骨细胞形成过程中，染色质状态由早期向晚期转变的重要节点。

图1 实验设计、方法概述和数据质控

2、成骨过程中染色质可及性和TF调控网络的动态变化
在四个不同的时间点，染色质可及性发生了显著变化，表现出与基因表达谱相似的特征。四组均存在44350个可及性染色质峰，差异表达的可及性染色质峰从0天逐渐减少到21天，从13299个峰减少到2092个峰(图2A)。此外，对上游调控峰和下游调控峰进行进一步分析后，发现在四组中有2547个可及性染色质峰可以显示上调功能，有3211个可及性染色质峰显示下调功能(图2B和2C)。图D-G显示了可及性染色质峰在基因组不同区域的分布，峰主要集中于基因组的远端基因间区、内含子区和启动子区。在第7天组启动子区所占的比例最高，染色质可及区域中含子区域的比例从0天到7天下降，从7天到21天增加。这些结果证明，成骨细胞早期染色质可及性和基因功能元件分布比例发生了显著的动态变化。

图2 成骨细胞分化与矿化过程中染色质可及性变化特征

3、综合分析ATAC-seq和RNA-seq数据揭示了染色质可及性与基因表达的关联性
启动子和增强子分别作为转录起始和放大转录起始效应，在基因表达中起着至关重要的作用。在所有样本中，ATAC-seq reads都富集在转录起始位点(TSS)周围(图3A、B)，证明了可达区检测的准确性。此外，RNA-seq的热图显示了转录水平上的差异表达基因情况(图3C)，图3D和3E显示了上下游的ATAC-Seq的染色质可及性差异。ATAC-Seq的结果在mRNA水平上与成骨过程中基因的表达密切相关。此外，为了更好地理解这种相关性，将样本组两两比较之后，根据启动子可访问性和表达水平的相关性，将这些基因分成了三组(图3F-K)。在这些相关分析中，发现RNA-Seq结果与ATAC-Seq结果呈正相关。具体来说，第1阶段(0天至7天)的相关指数非常高，而第3阶段(14天至21天)的相关指数正常。结果表明，ATAC-Seq和RNA-Seq之间的调控关系在成骨细胞形成的早期阶段表现得最为相关。总之，这些发现揭示了染色质可及性和基因表达之间的潜在联系，有助于理解成骨细胞分化和矿化过程中复杂的基因调控网络。

图3 成骨细胞分化和矿化不同阶段ATAC信号变化与基因表达的关系

为了研究成骨过程中染色质可及性对附近基因表达的调控，基于基因组峰注释进行了差异表达基因(DEGs)之间的关联分析。结果显示，ATAC-Seq和RNA-Seq中有106个基因上调，142个基因下调(图4A、B)。图4C和4D所示为成骨过程中不同组的差异基因表达和染色质可及性差异热图。图4E-H为DEGs的KEGG通路和GO分析。GO分析显示，上调基因大部分富集于“粘附连接”、“调节细胞-细胞粘附”、“上皮细胞增殖”、“胰岛素应答”等；下调基因主要富集在“早期核内体”、“防御反应正调控”和“内肽酶活性”上。KEGG通路富集结果表明，上调基因大部分富集于“轴突引导”和“流体剪切应力与动脉粥样硬化”中；下调基因富集于“类固醇激素生物合成”中。以上结果表明，成骨细胞形成过程中染色质可及性的变化可能与mRNA水平上的基因表达密切相关。

图4 动态成骨过程中ATAC-Seq和RNA-Seq变化结果的综合分析

4、成骨细胞分化和矿化过程中阶段特异性靶基因的mRNA表达水平
由于特定转录程序的激活在成骨分化中起着至关重要的作用，本研究检测了阶段特异性RNA-seq的水平变化，并用qPCR进行了验证(图5A)。观察到Col6a3、Serpina3n、Ms4a4d、Lyz2、Phf11B和Grin3a在成骨细胞分化和矿化过程中的表达呈现出相同的趋势。发现Nckap5、Gm45471、Cyp7b1、Sorbs2和Iigp1的表达在成骨后期(14天至21天)没有显著差异(图5B)。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络也表明，Serpina3n、Lyz2和Iigp1可以在上调信号通路上与任何其他基因相互作用(图5C)。同时发现Col6a3可能在成骨过程中与Sdc1发生相互作用(图5D)。

图5 根据RNA-Seq结果验证和潜在的相互作用

5、根据ATAC-Seq和RNA- Seq的综合分析，AME (Analysis of Motif Enrichment)揭示了潜在TF的时序调控
TF通过向DNA序列招募RNA聚合酶来促进基因转录，其中染色质可及性在TF结合中起重要作用。因此，通过AME分析来鉴定和量化潜在的调节成骨的TF。研究结果显示，510个TF与关键成骨基因的表达密切相关(图A)，并于AME分析结果取交集，发现4个TF(图A)。在这4个阶段成骨过程中上调的TF分别是MEF2A、PRRX1和Shox2，下调的TF是HOXB13(图B)。TF通过识别和结合特定的DNA序列(基序)来调节染色质重塑和转录。因此，改变TF结合基序的可及性对TF介导的基因调控在成骨过程中至关重要。使用HOMER发现了几个TF结合基序，它们位于可变的可达染色质区域。此外，重点研究了这些分布在MEF2A、PRRX1、Shox2和HOXB13区域的TF基序(图C)。
为了更直观地展示染色质可及性调控基因表达的机制，利用IGV同时呈现了Col6a3、Serpina3n、Ms4a4d、Ly2z、Phf11b和Grin3a等成骨细胞分化和矿化相关基因的靶信号RNA-seq分析。靠近TSS的启动子区域内的ATAC-seq信号明显高于其他基因区域(图D)。
综上所述，TF的AME动态变化分析表明，潜在TF的时序调控介导了MSCs的成骨细胞分化和矿化。许多TF，如MEF2A、PRRX1、Shox2和HOXB13，可能与其他TF密切相互作用，形成TF复合物，发挥关键作用。

图6 TF结合基序分布在MSCs成骨过程中染色质可及性变化区

三、研究结论
利用RNA-seq和ATAC-seq构建了MSCs成骨过程中的基因表达谱和染色质可及性动态图谱。确定了与成骨细胞形成相关的重要信号通路、TF（MEF2A、PRRX1、Shox2和HOXB13）和靶基因。这些发现可能为成骨细胞分化和矿化过程中染色质可及性的潜在分子调控机制提供新的研究基础。

参考文献：
Dynamic chromatin accessibility landscapes of osteoblast differentiation and mineralization.[J]Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease, 2023.