2022年发表于《Cells》（IF =7.6）

一、研究背景
钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)是世界范围内最常见的瓣膜病变，目前的治疗对CAVD效果有限。CAVD是一种进行性疾病，涉及多种信号通路、脂质积累、慢性炎症、成骨分化和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)重组等病理生理过程。临床治疗迫切需要阐明疾病的分子机制，寻找新的治疗靶点。

非编码RNA (ncRNAs)占人类基因组RNA转录本的90%以上，虽缺乏编码蛋白的潜力，但对包括心血管疾病在内的细胞功能至关重要。ncRNA包括microRNA和lncRNA。lncRNA对基因表达的表观遗传、转录和转录后调控非常重要，是CAVD进展的重要参与者。很多证据表明，作为ceRNA，一些lncRNA通过结合常见的miRNA影响下游mRNA的表达。一些失调的lncRNA在CAVD的进展中发挥着关键作用，这表明它们在瓣膜细胞的成骨分化和ECM重塑中具有潜在的作用。到目前为止，关于lncRNA相关的ceRNA调控网络在CAVD中的作用的研究还很少。

在本研究中，通过公共功能基因组数据库GEO分析了CAVD患者的lncRNAs和mRNA的全基因组表达谱。此外，通过综合分析建立了CAVD特异性ceRNA网络，ceRNA网络将有助于发现CAVD新治疗靶点和途径；并验证了这些lncRNA和miRNA在人钙化主动脉瓣组织和正常对照中的表达。

二、研究结果
1、样本数据处理及差异表达基因的鉴定
CAVD患者差异表达基因为1831个，其中上调基因1114个，下调基因717个。

图1 钙化与非钙化主动脉瓣组织差异表达基因

2、功能富集分析
通过基因集富集分析(GSEA)、GO和KEGG富集分析，探讨基因表达的功能。如图2所示，在CAVD样品中，细胞外基质(ECM)受体相互作用和ECM相关功能的基因显著富集。

图2 钙化和非钙化主动脉瓣组织全基因表达的基因集富集分析(GSEA)

对CAVD样品的1831个DEmRNA进行GO和KEGG途径富集分析。GO分析表明，差异表达基因在生物过程中主要与细胞外结构组织和细胞外基质组织相关(图3A)。ECM、含胶原的ECM和与ECM相关的细胞成分显著富集(图3B)。在前10位分子功能中，受体调节剂活性、受体配体活性、G蛋白偶联受体活性、ECM结构成分、ECM结构赋予抗拉强度显著增强(图3C)。KEGG富集分析显示，ECM-受体相互作用途径在所有1831个DEmRNAs(图3D)、1114个上调的DEmRNAs(图3E)和717个下调的DEmRNAs(图3F)中均显著富集。富集通路的相互作用网络显示，细胞表面受体信号通路、信号受体激活剂活性、ECM组织等显著增强(图3G)。这些数据表明，CAVD中差异表达基因与ECM受体相互作用途径和ECM重塑有关。


图3 GO和KEGG富集差异表达基因

3、蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络的构建及参与ECM相关生物学的基因簇研究
为了从CAVD样本中的DEmRNA中筛选出关键基因，将1831个DEmRNA上传到STRING网站进行进一步分析，得到了包含1669个节点和16190条边的PPI网络。接下来使用MCODE插件对网络进行分析，找出得分前5的基因簇。选择聚类1中得分最高的72个基因进行GO和KEGG富集分析，表明该聚类基因主要参与ECM受体相互作用途径和ECM相关功能。将聚类1中的连锁基因在STRING中构建成网络(图4A,B)。将基因簇1上传至Network Analyst，发现参与ECM受体相互作用途径的分子被突出显示，如图4C所示。

图4 MCODE评分最高的基因cluster1功能富集

4、miRNA的进一步挖掘和mRNA-miRNA相互作用网络分析
在基因簇1的72个关键基因中，筛选出37个与ECM受体相互作用途径相关的差异表达基因。然后使用miRWalk 3.0程序进行mRNA-miRNA互作分析，预测结果是从TargetScan、miRDB和miRWalk数据库预测的miRNA交集中选择的。利用Cytoscape构建mRNA-miRNAs相互作用网络(图5)。具有大量共享DEmRNA(≥2)的miRNA作为关键miRNA 。

图5 细胞外基质相关基因与其靶miRNA的相互作用网络

5、CAVD中lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络的构建
关键 miRNA对应的lncRNA通过ENCORI软件进行预测，预计113个lncRNA与关键miRNA相互作用。利用Cytoscape构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络，如图6A所示。为了获得更详细的生物学见解，分别分析了CAVD中mRNA的上调或下调网络(图6B，C)。

图6 CAVD中的LncRNA-miRNA-mRNA网络

6、lncRNAs在ceRNA网络中潜在表达的验证
为了验证ceRNA网络中潜在的113个lncRNA，首先对GSE199718中的DElncRNA进行了分析，筛选出CAVD中有152个lncRNA上调，114个lncRNA显著下调。在ceRNA网络中发现了3个DElncRNA：H19、SNHG3和ZNF436-AS1(图7A)。然后，在50例人主动脉瓣组织(钙化30例和非钙化20例)中使用RT-qPCR验证了这3种lncRNAs，钙化主动脉瓣组织中H19、SNHG3和ZNF436-AS1(图7B)的表达量显著高于非钙化对照组。钙化主动脉瓣中SNHG3升高，通过上调BMP2通路促进VICs成骨分化。
此外，还使用RT-qPCR检测了预测的miRNA（这些miRNA受H19、SNHG3和ZNF436-AS1的调控）在人主动脉瓣中的表达。发现has-miR-326 (p = 0.0005)、has-miR-29a-3p (p = 0.0002)、has-miR-148a-3p (p = 0.0006)、has-miR-106b-5p (p<0.0001)、haslet-7d-5p (p<0.0001)和has-let-7e-5p (p = 0.0075)在钙化主动脉瓣组织中显著下调(图7C-H)。因此，构建了一个竞争性内源网络，包括钙化主动脉瓣中验证的上调lncRNAs (H19、SNHG3和ZNF436-AS1)、下调miRNAs (has-miR-326、has-miR-29a-3p、has-miR-148a-3p、has-miR-106b-5p、haslet-7d-5p、has-let-7e-5p)和上调mRNA (COL4A1、COL1A1、COL6A3、THBS1、ITGB3、LAMA4、ITGA11、FRAS1、TNC)(图7I)。


图7 ceRNA网络中lncRNA和microRNA的验证

三、研究结论
CAVD中共鉴定出1739个DEmRNA和266个DElncRNA。GO、KEGG通路、GSEA注释表明，这些基因大多富集于细胞外基质(ECM)-报告基因相互作用通路中。构建了与ECM-reporter相互作用相关的ceRNA网络，相关lncRNA包括H19、SNHG3和ZNF436-AS1在人钙化主动脉瓣组织中显著上调，这可能是CAVD的潜在治疗靶点。

参考文献
Integrated Analysis of LncRNA-Mediated ceRNA Network in Calcific Aortic Valve Disease.[J]Cells, 2022.