2022年发表于《Journal of Translational Medicine》（IF =7.4）

一、研究背景
肺腺癌(LUAD)是肺癌最常见的组织学亚型，其生存率较低；发生转移是LUAD患者预后不良的一个特征，也是其主要死亡原因。LUAD的发生、进展和转移的机制仍不清晰。polyc -RNA结合蛋白1 (PolyC-RNA-binding protein 1, PCBP1），是异质核核糖核蛋白复合物的一个组成部分，并调节许多癌症相关基因的选择性剪接、翻译和RNA稳定性。PCBP1通过结合其靶mRNA来调节基因表达。PCBP1已被证明是一种肿瘤抑制因子，与各种肿瘤的发生和发展密切相关。然而，PCBP1在LUAD肿瘤发生和转移中的作用的研究较少。Wnt信号通路在癌症的发生和转移中发挥重要作用，而PCBP1的减少是肿瘤细胞转移的关键特征。本研究通过一系列实验，验证了PCBP1通过上调DKK1使Wnt/β-catenin通路失活来抑制LUAD的发展。

二、研究结果

1、PCBP1低表达预示肿瘤患者预后不良

PCBPs参与了不同水平的基因表达调控，其中一些成员在肿瘤发生中起重要作用。hnRNP家族在肿瘤组织中显著下调，而PCBP1在早期死亡组和长期生存组中表达差异最显著(图1A)。K-M生存曲线显示，PCBP1低表达组的总生存率在TCGA和GSE19188队列中都明显较差(图1B)。PCBP1的表达在远处转移患者对应的IV期癌症组织中显著降低(图1C, D)。这些结果显示PCBP1在肺肿瘤发生中起重要作用。

为验证PCBP1在LUAD中的表达及其对诊断的预测价值，随后的免疫组化显示，PCBP1在肺肿瘤组织中表达降低(图1E、F)。PCBP1与肿瘤侵袭、淋巴结转移和临床分期有显著相关性(图1F)。我们对比配对的肺腺癌正常组织和肿瘤组织，发现肿瘤中PCBP1 mRNA水平较低，与三个病理参数之间显著的相关性(图1G)。PCBP1在蛋白和mRNA水平上的低表达与LUAD患者的不良生存率密切相关(图1H, I)。综合这些数据，发现PCBP1是LUAD患者潜在的预后生物标志物。


图1 鉴定PCBP1的预后和潜在的生物学价值

2、PCBP1抑制LUAD细胞的体外增殖和迁移

在A549和H358细胞中使用两个shRNA，生成PCBP1稳定敲低细胞系。通过western blot和qPCR证实了PCBP1缺失的有效性。PCBP1敲低显著增加了A549和H358细胞的集落形成(图2A, B)和细胞增殖。相反，PCBP1过表达减少了集落形成和细胞增殖。观察到shPCBP1细胞的细胞增殖率增加(图2D, E)， PCBP1过表达抑制细胞增殖(图2F)。与对照细胞相比，shPCBP1细胞表现出更高的细胞迁移能力(图2G, H)，在过表达PCBP1的细胞中下降。由此可知PCBP1能抑制肺腺癌的进展。


图2 PCBP1对LUAD体外增殖和迁移的影响

3、PCBP1与肺腺癌患者的肿瘤转移相关

为了研究PCBP1对LUAD的分子调控机制，对PCBP1敲除后的A549细胞进行了RNA测序，643个下调基因和490个上调基因(图3A)。GO和KEGG分析显示，DEGs主要富集于与肿瘤转移相关的生物过程：细胞粘附、分子结合、上皮迁移(图3B)和Wnt信号通路(图3D)，这些通路都与肿瘤转移有关。上皮间质转化(EMT)是肿瘤转移的重要生物学过程，从“HALLMARK_EPITHELIAL_ MESENCHYMAL_TRANSITION”基因列表中获得EMT相关基因，使用热图显示(图3C)。在Wnt通路中，PCBP1敲低细胞与对照组相比，有6个基因表达上调，10个基因表达下调(图3E)。根据PCBP1的表达情况，将TCGA LUAD患者分为高表达组和低表达组。在GSEA结果中，PCBP1低表达组中也富集了“上皮-间质转化”途径(图3F)。选择了22个DEGs，通过qRT-PCR验证PCBP1敲低和过表达细胞的RNA测序结果(图3G)。这些发现揭示了PCBP1与LUAD转移之间的联系。


图3 PCBP1表达与肿瘤转移的联系

4、PCBP1通过直接结合DKK1 mRNA抑制LUAD进展，并延长其mRNA稳定性

DKK1属于与肺癌转移相关的Wnt信号通路。上述实验结果也显示DKK1可能是PCBP1影响肿瘤转移的关键因素(图4A)。在A549和H358细胞中，PCBP1敲低会降低DKK1蛋白水平，而在A549细胞中，PCBP1过表达会增加DKK1 mRNA水平和蛋白水平(图4B，C)。为了确认PCBP1和DKK1之间的相互作用，进行了RIP分析。RIP分析显示DKK1在A549细胞中与PCBP1结合(图4D)。此外，使用A549细胞裂解物进行RNA pull-down，然后进行western blot分析和银染色(图4E)，证实了DKK1与PCBP1在细胞中结合。又评估了DKK1 mRNA对放线菌素D治疗的敏感性，PCBP1的过表达可以延长DKK1 mRNA的半衰期(图4F)。结果表明PCBP1通过控制DKK1 mRNA的稳定性调控DKK1的表达。


图4 PCBP1调控DKK1 mRNA的稳定性

5、PCBP1靶向DKK1抑制Wnt/β- catenin通路

DKK1是Wnt/β- catenin的抑制剂，DKK1的失调是多种癌症发生的一个重要因素。Western blot分析显示，β-catenin在PCBP1敲低细胞中表达上调，在PCBP1过表达细胞中表达下调。而phospho-β-catenin的表达则相反(图5A)。此外，通过western blot检测EMT相关标志物水平，表明PCBP1降低了Vimentin水平，但升高了claudin-1水平(图5A)。Transwell实验显示，与对照细胞相比，shPCBP1细胞表现出更高的细胞迁移能力(图5B)。
为研究PCBP1是否通过调节DKK1来抑制细胞迁移，通过siDKK1沉默A549和PCBP1-OE A549细胞中的DKK1。RT-qPCR结果显示，si-DKK1#1和si-DKK1#2的敲除效率良好(图5C)。PCBP1- e转染的A549细胞显示磷酸化-β-catenin和cludin -1水平升高，β-catenin和vimentin水平降低，但si-DKK1逆转了这些结果(图5D)。进一步研究了PCBP1在LUAD癌症转移中的作用，PCBP1过表达的A549细胞表现出明显的细胞迁移能力下降，而DKK1的下调则细胞迁移能力得以恢复(图5E)。以上数据表明DKK1是PCBP1重要的下游靶点。


图5 PCBP1/DKK1/β-catenin调节LUAD细胞的迁移和EMT

6、PCBP1在体内抑制LUAD的肿瘤生长和转移

为了探讨PCBP1在肺转移中的生物学功能，将PCBP1敲除细胞注入小鼠尾静脉。PCBP1敲低显著降低了H358小鼠模型的体重，并加重了A549(图6A-C)和H358(图6D - F)小鼠模型的肺转移负担。还研究了PCBP1对体内致瘤性的影响，在皮下异种移植模型中，PCBP1敲低组的肿瘤体积似乎比对照组大(图6G，图6H)。PCBP1过表达组的肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤更小，肿瘤重量更轻(图6I)。此外，免疫组化分析表明，转染shPCBP1后，肿瘤组织中Ki67阳性细胞显著增加，转染PCBP1后，肿瘤组织中Ki67阳性细胞显著减少。测量BALB/c nu小鼠切除肿瘤的重量，PCBP1抑制肿瘤生长和重量(图6J)。总之，以上数据表明PCBP1调控LUAD肿瘤生长和转移。


图6 PCBP1在体内抑制LUAD的肿瘤生长和转移

7、LUAD患者PCBP1与DKK1呈正相关

为了检验以上发现的临床相关性，用免疫组织化学染色检测了72对LUAD癌症和正常组织中PCBP1、DKK1和β-catenin的表达。数据显示，与配对的正常肺组织相比，肿瘤组织中DKK1蛋白表达下降，β-catenin蛋白表达增强(图7A，B)。DKK1高表达与LUAD患者生存率提高密切相关，而β-catenin高表达预示预后不良(图7C)。

与此同时，IHC染色结果显示DKK1和β-catenin表达与肿瘤大小、肿瘤分期有关(图7D)。PCBP1评分较高的组织显示DKK1表达增加，β-catenin减少。相反，PCBP1评分越低的组织，DKK1表达水平越低，β-catenin表达水平越高(图7E)。这些结果表明LUAD中PCBP1和DKK1呈正相关，PCBP1和DKK1均与β-catenin呈负相关(图7F)。在TCGA和GSE19188数据库中验证了相同的结果(图7G)。这些结果表明PCBP1与DKK1呈正相关，PCBP1和DKK1与β-catenin呈负相关，而β-catenin是LUAD 总生存期的独立预后标志物。


图7 LUAD中高水平的PCBP1和DKK1表达预示着良好的临床预后

三、研究结论

通过研究PCBP1、DKK1 和β-catenin的调控关系，证明PCBP1通过上调DKK1，使Wnt/β-catenin通路失活来抑制LUAD的发展。PCBP1可能作为一种判断预后的新标志物和潜在的治疗靶点。

参考文献

The RNA-binding protein PCBP1 represses lung adenocarcinoma progression by stabilizing DKK1 mRNA and subsequently downregulating β-catenin.[J]Journal of Translational Medicine, 2022.