2022年发表于《Nature Communications》（IF =17.7）

一、研究背景
急性肾损伤(AKI)是一种常见的临床综合征，表现为肾功能突然下降，持续数小时或数天，导致废物积累，损害肾脏和身体其他部位。目前，AKI患者只能通过支持疗法进行治疗，尚缺乏减少组织损伤或促进修复的有效疗法。众所周知，肾小管上皮细胞(TECs)最容易受到AKI的影响。在轻度损伤后，成熟存活的TECs可以启动适应性修复过程，经历去分化、增殖和随后的再分化，以补充丢失的上皮细胞。相反，TECs在严重损伤后往往会发生不良反应，导致慢性损伤和纤维化表型。
表征AKI后的染色质动力学和分析TF调节网络可能阐明细胞对不同程度损伤反应的表观遗传学基础，从而确定适应性和非适应性肾脏修复的关键调节因子。在本研究中，分析了不同严重程度AKI后，小鼠肾TECs中染色质可及性和基因表达的动态变化，并构建和区分了TF调控网络。发现核受体RXRα是一个主要的TF，它决定了轻度或重度AKI的差异染色质状态和基因表达，RXRα的激活可以保护TECs免受严重AKI的影响。

二、研究结果
1、AKI后TECs的染色质动力学研究
为了探索AKI后适应性修复和非适应性修复期间全基因组染色质的变化，使用ATAC-seq检测假手术组、轻度肾损伤组（MI）TECs的染色质可及性动态变化(图1a和2a)，得到四组差异染色质可及性区域(DARs)（图1b）。大多数DARs位于启动子和远端调控区（图1c），GO分析显示一些元件调控的基因促进了受损TECs的恢复（图1d）。图1e展示了轻度肾损伤（MI）后有代表性的差异染色质可及性区域(DARs)的变化情况。接下来，严重肾损伤（SI）TECs中的DARs进行了相同的分析，得到了类似结果（图2）。


图1 轻度肾损伤后TECs的染色质可及性图谱


图2 严重肾损伤后TECs的染色质可及性图谱

2、损伤特异性染色质开放先于基因激活
为了区分适应性修复和非适应性修复的染色质变化，在轻度肾损伤（MI）和严重肾损伤（SI）后的第2天和第7天对TECs进行了ATAC-seq测序。结果表明，第2天和第7天，MI TECs和SI TECs表现出不同的染色质可及性图谱，在第2天，MI和SI之间开放染色质结构域的明显差异就出现了(图3a)。在第2天和第7天对AKI模型的TECs以及假手术小鼠的TECs进行RNA测序(RNA-seq)。数据表明，与染色质开放度的快速变化相反，基因表达的改变明显延迟。同时，对ATAC-seq和RNA-seq数据的综合分析显示，AKI后第2天，MI TECs和SI TECs之间染色质可及性的差异与基因表达变化的相关性较弱(P = 3.08×10-3)(图3c)。相比之下，在损伤后第7天，染色质可及性的变化与基因表达的变化有很强的相关性(P =2.20×10−16)，H3K27ac ChIP-seq分析结果与基因表达一致，MI-DARs和SI-DARs中H3K27ac差异峰信号在第7天高于第2天(图3d)。通路分析显示，SI TECs中染色质可及性和基因表达较低的区域富集了肾功能基因，(图3g, h)，表明SI TECs处于功能失调状态，这意味着SI TECs具有更高的纤维化和炎症潜能。


图3 损伤特异性染色质的开放介导基因激活

3、在适应性修复过程中，DARs富含RXRα motifs
开放的染色质结构域在很大程度上是由TFs建立和维持的，以控制基因表达。为了确定在不同肾损伤反应中负责调节染色质状态动态的关键TFs，分析了MI-DARs和SI-DARs上的TFs motifs。绘制了损伤后第2天和第7天MI-DARs和SI-DARs的TF调节网络。发现HNF4α、PPARα和RXRα是调MI-DARs染色质结构的核心TFs(图4d)，而FOSL2和MEF2A是SI-DARs中富集的关键TFs(图4e)。该发现与HNF4α和PPARα之前的报道一致，说明了网络分析识别潜在参与损伤反应的TFs的可行性。在轻度肾损伤（MI）后的TECs中，RXRα是网络中富集最显著的TF，并对其进一步分析(图4d)。

图4 适应性和非适应性修复中的转录因子调控网络

4、RXRα结合与染色质开放和基因表达相关
MI-DARs的ChIP-seq分析结果显示，约25%的MI-DARs中检测到RXRα结合（图5a）。将MI-DARs分为两组RXRα结合区和RXRα未结合区，并对RXRα 的ChIP-seq和ATAC-seq进行了整合分析，表明RXRα结合与染色质开放度呈正相关(图5c)。在与MI-DARs相关的基因中，RXRα结合基因的mRNA水平显著高于RXRα未结合基因(P = 1.76×10−13)(图5d)。总之，这些结果表明RXRα结合与轻度肾损伤（MI）后TECs的染色质开放和基因激活呈正相关。与轻度肾损伤（MI）组和假手术组相比，重肾损伤（SI）组TECs中RXRα mRNA和蛋白表达均下降（图5e、f），与此同时，SI TECs中MI-DARs中的RXRα结合和染色质可及性均显著降低(图5g)。
为了进一步探讨RXRα结合减少对SI TECs基因表达的影响，比较了这些RXRα结合基因和MI- DARs相关基因在MI和SI TECs中的基因表达。319个RXRα靶基因进行GO分析，发现与多种代谢过程和离子运输相关的途径富集(图5h)，这对肾功能和修复恢复至关重要，将这319个基因定义为RXRα活化基因。
为了进一步探讨RXRα结合减少对SI TECs基因表达的影响，比较了这些RXRα结合基因和MI- DARs相关基因在MI和SI TECs中的基因表达。319个RXRα靶基因进行GO分析，发现与多种代谢过程和离子运输相关的途径富集(图5h)，这对肾功能和修复恢复至关重要，将这319个基因定义为RXRα活化基因。


图5 RXRα的结合与染色质开放和基因表达相关

5、激活RXRα可保护严重肾损伤（SI）后的TECs
为进一步研究，激活RXRα是否可以促进肾修复并改善严重肾损伤（SI）后肾纤维化，对SI小鼠进行了Bexarotene (Bex，选择性激活RXRα的药物)处理。Bex给药大大降低了SI小鼠的死亡率，SI后第7天存活率从41.66%左右增加到100%(图6a)。Bex治疗还减少了SI后第2天的肾小管损伤(图6b)和血清肌酐水平(图6c)。到第30天，观察到Bex治疗小鼠的BUN水平大幅下降(图6d)，表明肾功能得到改善。Col3a1和Fn1 mRNA水平的测定(图6e)，马松染色和α-SMA阳性区域的定量来评估肾纤维化，显示Bex治疗后肾脏纤维化明显减少(图6f)。上述结果表明，RXRα的激活可以保护TECs免受严重肾损伤。

图6 Bex治疗保护TECs免受严重伤害

6、Bex可以恢复严重肾损伤（SI）后的染色质状态和基因表达程序
为了阐明严重肾损伤（SI）后Bex介导的肾保护的分子机制，分析了在轻度肾损伤（MI）和SI后第7天RXRα结合、染色质可及性和基因表达情况。经Bex处理后，SI小鼠MIDARs中RXRα的基因组占用率显著增加，将RXRα结合恢复到与MI小鼠相当的水平（图7a）。ATAC-seq分析显示，经过Bex处理后，SI小鼠MIDARs中染色质可及性发生了重编程(图7b)。RXRα在MIDARs上结合的增加与Bex处理后SI小鼠染色质可及性的增加呈正相关(图7c)。重要的是，Bex处理诱导了RXRα活化基因的显著上调(图7d,e)。
综上所述，这些发现表明，Bex治疗通过增加RXRα的募集和RXRα相关的染色质重塑来激活基因，从而保护SI小鼠的TECs免受急性损伤。

图7 RXRα的激活可重编程染色质状态和基因表达

7、RXRα表达与AKI患者疾病严重程度相关
利用小鼠和人AKI的scRNA-seq数据集，评估了PTC亚群中RXRα和RXRα活化基因的表达。RXRα和RXRα活化基因的表达随着损伤程度的加重而降低（图8a-c）。肾损伤严重程度与RXRα或其靶基因的下调呈正相关(图8d, e)。
为进一步验证RXRα在AKI中的临床相关性，进行了临床验证(n = 28)。肾毒性10例，缺血性损伤7例，缺血性合并肾毒性损伤3例，其他3例，未知5例。AKI患者组织切片采用免疫组化染色法检测RXRα的表达，癌旁肾组织作为对照，RXRα在SI患者肾脏中的表达显著降低（图8f）。此外，RXRα在AKI 2期和3期患者中的表达低于AKI 1期患者，表明RXRα表达与AKI的临床严重程度呈负相关(图8g)。进一步分析显示，RXRα表达水平与Scr、BUN的含量呈负相关(图8h)。上述数据表明，严重AKI患者肾小管RXRα表达减少，与肾小管损伤和肾修复失败相关。


图8 AKI小鼠和患者中RXRα表达与肾疾病严重程度呈负相关

三、研究结论
RXRα是促进急性肾损伤(AKI)适应性修复的关键转录因子，Bex可以激活RXRα，恢复染色质状态和基因表达，保护TECs免受严重肾损伤。RXRα是急性肾损伤的潜在治疗靶点。

参考文献：
Chromatin accessibility dynamics dictate renal tubular epithelial cell response to injury.[J]Nature Communications, 2022.