图1 Linc1405对心脏分化至关重要

2、Linc1405调节驱动心脏分化的核心基因网络
本研究重点探讨了linc1405决定中胚层细胞命运的分子机制。鉴定出在linc1405-敲低MES细胞中差异表达的65个上调基因和124个下调基因(图2A和2B)。上调的基因主要与骨骼发育和器官形态发生相关，基因的分子功能将其归类为转录因子。相应的，下调的基因主要被分类为转录因子和DNA 结合蛋白，主要与多细胞生物发育和细胞分化相关(图2C)。
GO分析显示，DEGs主要富集于模式形成过程、肌肉组织发育、心脏发育相关，肌肉结构成分、蛋白质结合、钙离子结合等通路(图2H)。linc1405可能是心脏中胚层特异性发育的重要调节因子，因为它的敲除会阻断心脏的命运决定。


图2 Linc1405调节驱动心脏分化的核心基因网络

3、心脏中胚层发育过程中Linc1405与Eomes相互作用
通过RNA免疫沉淀(RIP)实验，证实了外源性和内源性Eomes都可以与linc1405结合(图3B和3C)，并且表明linc1405与Eomes有特异性相互作用。Eomes的破坏导致心脏中胚层分化缺陷和原肠形成缺陷导致的胚胎致死。
通过建立敲除Eomes的ESCs(减少40%)，Eomes的敲除显著降低了EB自发搏动的比例，降低了EB分化表达水平，降低了cTnT+ CM的比例(图3D-3G)。建立敲除Eomes、过表达linc1405的ESCs，与过表达linc1405的EBs相比，Eomes敲除后，跳动EBs的百分比、心脏标志物的表达水平和cTnT+细胞数量均显著降低(图3H-3J)。研究结果证实，Eomes是心脏分化的关键因素，linc1405/Eomes相互作用是linc1405在心脏谱系分化中的功能所必需的。


图3 心脏中胚层发育过程中Linc1405与Eomes相互作用

4、Linc1405的外显子2负责Eomes结合和心脏分化
Linc1405主要由两个外显子组成，RIP和RNA pull-down实验结果显示Eomes主要结合linc1405的外显子2，而不是外显子1(图4A、4B)。然后，将linc1405的每个外显子敲入46C ESCs的ROSA26位点，外显子2的引入促进了收缩EBs的百分比、心脏特异性基因的表达和cTnT+细胞的数量，而外显子1的引入没有显著影响(图4C-4E)。后续构建了linc1405外显子2双敲除ESCs (Exon2DKO)，结果发现完全缺失linc1405外显子2显著抑制了ESCs的心脏分化，心脏标记物的表达受损，搏动EBs和cTnT+ CMs的百分比降低，Flk1+ Pdgfγα+中胚层细胞的百分比降低(图4I-4L)。综上所述，数据表明Eomes和Linc1405外显子2的相互作用是心脏分化的主导因素。


图4 linc1405的外显子2负责Eomes结合和心脏分化

5、Mesp1是Linc1405在心脏分化过程中的功能靶点
在心脏命运决定过程中，Mesp1是Eomes的关键下游靶点，并驱动心脏分化。在EB细胞分化过程中，敲低linc1405时，Mesp1的表达水平显著降低，而在linc1405过表达后，Mesp1的表达水平升高(图5A-5D)。外源性Mesp1的引入显著缓解了两株linc1405敲除的ESC细胞系中EBs的心跳百分比和cTnT+心脏细胞的数量(图5E、5F)。与linc1405基因下调细胞相比，Mesp1过表达在EB和CM分化过程中强烈诱导心脏特异性基因的表达(图5H和5I)。这些结果表明，在心脏发育过程中，Mesp1可能是linc1405的功能靶点。


图5 Mesp1是linc1405在心脏命运决定过程中的功能靶点

6、Linc1405/Eomes将TrxG组分和GCN5组装成多蛋白复合物调控Mesp1基因增强子
小鼠中Mesp1的破坏会导致心脏发育缺陷和心脏中胚层缺陷，从而引起胚胎致死，研究数据显示，Eomes蛋白在Mesp1基因MTbx位点的富集显著降低，但在MTss位点没有显著改变(图6B和6C)。RIP实验显示linc1405与WDR5和GCN5相互作用，敲除linc1405或Eomes后，Mesp1基因MTbx位点上WDR5和GCN5的富集显著降低(图6H)。此外，当全长linc1405转录本导入到敲除linc1405的细胞时，MTbx位点Eomes、WDR5和组蛋白修饰的富集水平显著提高。这些结果表明，WDR5和GCN5被linc1405/ Eomes特异性地招募到Mesp1基因的增强子上。
共免疫沉淀(co-IP)实验的结果发现，WDR5不直接与Eomes或GCN5相互作用，而RNA pull-down实验的结果表明，linc1405的外显子2可以与WDR5和GCN5蛋白相互作用。荧光素酶实验结果表明，只有linc1405内显子2能够激活Mesp1增强子报告基因的荧光素酶活性（图6K）。结果表明，linc1405外显子2可能在Mesp1基因的增强子处介导Eomes/WDR5/GCN5复合物（图6L和6M）。


图6 Linc1405/Eomes在Mesp1基因的增强子上将TrxG组分和GCN5特异性组装成一个多蛋白调控复合体

7、Linc1405/ Eomes介导的复合物位于原条区域并调控心脏发育
Eomes在原条中表达，通过直接激活Mesp1表达促进早期心脏中胚层的形成。FISH分析显示，linc1405在胚胎的原条上表达(图7A)。WDR5和GCN5与Eomes在原条处共表达(图7B)。这些结果表明，linc1405/ Eomes与WDR5和GCN5在原条上共存。此外，构建了linc1405单基因敲除(SKO)小鼠、linc1405双基因敲除(DKO)小鼠，研究结果表明linc1405缺失导致心脏发育和功能受损。基于这些结果，提出了一个转录调控模型，其中linc1405通过联合WDR5和GCN5，调控Eomes激活Mesp1基因在原条的表达，这对正常的心脏发生至关重要(图7I)。


图7 Linc1405/ Eomes介导的复合体位于原始区域并协调心脏发育

三、研究结论
本研究结果表明，linc1405通过与Eomes的相互作用，来调节心脏分化的核心网络。染色质和RNA免疫沉淀实验表明，linc1405的外显子2介导了结合在Mesp1基因增强子区的复合物（该复合物由Eomes、TrxG的亚基WDR5和组蛋白乙酰转移酶GCN5组成），并在胚胎干细胞分化为心脏中胚层过程中激活其表达。同时，linc1405、Eomes、WDR5和GCN5共同定位于在原条上，且linc1405缺失会损害体内心脏的发育和功能。总之，linc1405介导Eomes/WDR5/GCN5复合物，有助于心脏发育，在体外和体内心脏发育的表观遗传调控中具有关键作用。

参考文献：
A Linc1405/Eomes Complex Promotes Cardiac Mesoderm Specification and Cardiogenesis. [J]Cell Stem Cell, 2018.