苏州京脉生物科技有限公司（京房生物母公司）继2021年7月授权早筛领域发明专利之后，于2021年11月30日又获国家知识产权局授权一项核心技术专利（一种肺癌早期检测的标志物、试剂盒及方法）（图1）。此项发明专利展现了京脉生物在测序领域，特别是早筛领域的研发实力，更标志着其在肺癌早期检测领域检测能力和准确性的提升。

图1 发明专利证书

肺癌是世界范围内发病病例和死亡病例数量最多的恶性肿瘤。2016年中国癌症中心统计显示，在429万新发癌症人群中，肺癌占据了73 .3万，而在280万的癌症死亡人群中，肺癌占据了61万。其中，非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％。肺癌早期病症不明显，因此约75％的患者在发现患癌时已处于肺癌中晚期，已有局部浸润和远端转移。晚期肺癌的五年生存率非常低，不足5%。但是，早期肺癌患者5年生存率可高达90％以上。因此，对肺癌的早期诊断是肺癌患者获得良好预后以及减少死亡率的重要方法。

肺癌的早期诊断方法主要包括：胸部影像学、痰脱落细胞学检测以及支气管镜检查等，而这些方法的检测效果目前并不理想。其中，胸部影像学检测方法包括：X胸片、低剂量螺旋CT（LDCT）和PET-CT等。肺癌在早期通常以肺结节的形式出现，尽管影像学检测提高了肺结节的检出率，但由于肺结节病因复杂且临床表现缺乏特异性，使得对其良恶性的鉴别有一定的难度。因此，X胸片检查的误漏诊率很高，可达50%以上；LDCT和PET-CT对于肺结节的检测特异性较差，在肺癌早期筛查和诊断中广泛应用的LDCT技术其检测假阳性可高达21%以上；并且，这些影像学受测者都需要承受辐射带来的健康风险。痰脱落细胞学检测，诊断中央型肺癌的敏感性约为50%，而对于周围性肺癌则不足20%。支气管镜检查尽管对于中央型肺癌的检测敏感性较高，但对于周围型肺癌的检测效果依然较差，并且这类侵入式检查难以在人群中大范围推广。因此，需要开发敏感性和特异性均比较高且大众易于接受的肺癌早期筛查技术。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为19-25个核苷酸的非编码短RNA。它能够通过与靶基因mRNA的3 'UTR完全或不完全配对，降解靶基因mRNA或抑制其翻译。过去的研究表明miRNA参与了多种调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖与死亡、等等。近年来，miRNA的丰度变化与肿瘤发生和发展的密切关系已经在科学界形成了共识并成为了目前的研究热点。大量研究表明，miRNA在不同肿瘤中有特异性的表达，根据一些miRNA的表达状态可以区分正常与肿瘤组织。此外，也有不少研究证实，血液中的循环miRNA可以作为包括癌症在内的各种疾病的诊断标志物，例如中山大学研发的基于血清miRNA的肝癌检测试剂盒。然而，目前关于循环miRNA作为肺癌诊断标志物的研究仍然存在一些不足，例如：（1）很大一部分研究只是挑选了前人报道的在肺癌组织中表达失调的miRNA作为候选指标，而这些miRNA在血清中并不一定是最优的选择。（2）一些研究使用了microarray进行了miRNA标志物的初步筛选，但与二代测序相比microarray的信噪比较差，因此其筛选出的miRNA标志物并不一定是优选。（3）能够通过去除PCR重复从而提高血清miRNA定量准确性的随机标签序列尚未在此类研究中得以广泛应用。因此，目前仍然有必要研发具有临床应用价值的肺癌早期检测标志物以及相对应的检测方法和试剂，以用于肺癌高风险人群的肿瘤检测，便于及早进行临床干预。
为了解决定量精准性问题，苏州京脉生物科技有限公司开发了精准分子定量技术。该关键技术是在测序文库构建时，对每一个miRNA分子添加单一的特异性分子标签，经过扩增后通过识别分子标签的种类可以准确追踪原始miRNA分子数目以及在所有miRNA中的相对占比。通过此举可大幅提升血清miRNA的定量准确度，同时避免了因为使用单一内参或者绝对定量阈值而带来的检测不稳定性，克服了二、三代PCR、常规高通量测序以及基因芯片等遇到的技术难题。公司自主设计的分子标签位于miRNA序列的5’端，其包含一段长度经过优化的随机碱基序列以及一段固定碱基序列。文库构建示意图见图2（箭头所指的黄色部分即为分子标签）:

图2 miRNA测序文库构建示意图

通过与全国多家医院开展合作，京脉生物累计获得了超过500例的血液样品，使用精准分子定量技术对循环miRNA进行准确定量，随后使用机器学习算法构建分类器，得到可以准确预测早期肺癌的miRNA标志物组合（19个miRNA）以及回归公式，实现了高达0.96的检测敏感性和特异性（图3）。

图3 早期肺癌miRNA标志物组合对应的ROC曲线图

目前，京脉生物已将基于精准分子定量技术的RNA测序服务推向市场，得到较好的市场反馈，随着进一步的研发投入和服务提升，相信该技术在未来给基础研究和临床应用带来更多的惊喜！